薯莨提取物通過KTN1反義RNA 1對食管癌細胞生物行為的影響

陳吉柏，范長玲，張浩

食管癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的第六大原因［1］。食管癌主要分為食管鱗癌和食管腺癌［2］。目前，即使采用外科手術(shù)切除或廣泛應(yīng)用全身放化療，食管癌治療對侵襲和遷移均無積極作用，病人的5年生存率并不樂觀［3］。因此，開發(fā)新的治療方法和天然抗腫瘤藥已成為食管癌治療中亟待解決的問題。薯莨為薯蕷科薯蕷屬藤本植物薯莨（Dioscorea cir?rhosaLour.）的干燥塊莖，具有活血補血，收斂固澀的功效，用于功能性子宮出血，產(chǎn)后出血，咯血，吐血，便血，尿血，腹瀉；外用治燒傷［4］。研究發(fā)現(xiàn)，薯莨提取物對肝癌、胃癌、食管癌、腎癌等多種惡性腫瘤具有一定的治療作用，其可抑制惡性腫瘤的生長［5］，但薯莨對食管癌細胞的具體影響及其機制目前還未有研究。長鏈非編碼RNA（lncRNA）長度超過200個核苷酸，但不編碼蛋白質(zhì)。lncRNA已經(jīng)被證明參與多種生命過程，如細胞增殖，遷移、侵襲和細胞凋亡［6］。KTN1反義RNA 1（KTN1 antisense RNA 1，KTN1-AS1），又稱MYCLo-3或C14orf33，是新近發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌和頭頸鱗癌中的致癌lncRNA，KTN1-AS1作為肝癌、肺癌的預(yù)后相關(guān)的lncRNA，在癌細胞中高表達，KTN1-AS1的敲除可抑制細胞增殖［7-8］。然而KTN1-AS1在食管癌中的生物學(xué)功能尚未見諸報道。基于此，本研究自2019年1月至2020年1月，探討薯莨提取物對食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并通過KTN1-AS1探索其分子機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑食管癌細胞Eca109購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心，RPMI-1640培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute）購自美國Hyclone公司，薯莨購自上海雷允上藥業(yè)有限公司，KTN1-AS1小干擾RNA（si-KTN1-AS1）、小干擾RNA陰性對照（si-NC）、KTN1-AS1過表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-KTN1-AS1）、過表達質(zhì)粒對照質(zhì)粒（pcDNA3.1）購自廣州銳博生物有限公司，Lipofectamine 2000試劑購自美國Invitrogen公司，兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）、上皮鈣黏素（E-cad‐herin）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.2薯莨提取物的制備薯莨提取物的制備參照文獻［5］的方案進行。取薯莨藥材粉末，以1∶10加入蒸餾水，90℃水煮30 min，重復(fù)2次，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1.5的濃縮液比重，之后加入乙醇沉淀，過濾干燥得到的紅棕色粉末即為薯莨提取物。用時使用二甲基亞砜溶解至所需濃度。

1.3細胞培養(yǎng)與處理Eca109細胞在補充有10%胎牛血清（FBS），100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在37℃和5%二氧化碳條件下孵育。每2天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細胞達到80%～90%融合時傳代。取生長狀態(tài)良好的Eca109細胞，用不同濃度（10、20和30 mg/L）的薯莨提取物處理細胞48 h，分別記為薯莨-L組、薯莨-M組、薯莨-H組。同時將未加藥物處理的Eca109細胞設(shè)為對照組。處理結(jié)束后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.4細胞轉(zhuǎn)染在6孔板中接種Eca109細胞，當(dāng)細胞達到70%融合，嚴(yán)格依照Lipofectamine 2000試劑說明書的指示，在Eca109細胞中轉(zhuǎn)染si-KTN1-AS1、si-NC、pcDNA3.1-KTN1-AS1、pcDNA3.1。其中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-KTN1-AS1和pcDNA3.1的細胞使用30mg/L薯莨提取物處理。細胞在37℃和5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)48 h后使用。

1.5細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）測定細胞增殖在96孔板中接種Eca109細胞（5×103個/孔），48 h后向每個孔中添加10μL CCK-8溶液，并將混合物在37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1 h，通過酶標(biāo)儀在450 nm波長處測量吸光度。細胞增殖的抑制率（%）=（1?實驗組吸光度/對照組吸光度）×100%。

1.6克隆形成實驗分析細胞克隆能力［9］Eca109細胞經(jīng)不同的處理后，接種于6孔板中培養(yǎng)約兩周。細胞菌落用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，蘇木精溶液染色，于顯微鏡下計算克隆形成數(shù)。

1.7蛋白質(zhì)印跡法檢測P21、E-cadherin、MMP-2蛋白表達Eca109細胞在冰上與RIPA裂解液混合30 min，然后將樣品在10 000g、4℃下離心10 min。使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)樣品（20μg），然后電轉(zhuǎn)移到冰的聚偏二氟乙烯膜上。在室溫下，用5%脫脂牛奶封閉膜1 h。隨后，將膜與抗P21、E-cad‐herin、MMP-2和GAPDH一抗在4℃下孵育過夜。用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（TBST）洗滌膜，并與二抗在室溫下孵育1 h。將膜用TBST洗滌5次，每次5 min，并使用增強的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯影。使用Image J軟件獲取和分析成像數(shù)據(jù)。以GAPDH為對照計算P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的相對表達。

1.8Transwell分析細胞遷移、侵襲Transwell小室（直徑8μm，24個孔）用于評估Eca109細胞的遷移和侵襲。遷移能力分析：通過胰蛋白酶消化收集Eca109細胞，并以2×105個/毫升的密度重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中。將細胞懸液（200μL）加入上室中。將500μL補充有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基添加到下室中。在37℃孵育24 h后，使用棉簽除去上室中的細胞，隨后在室溫下使用4%甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min并洗滌3次，對遷移到下室的Eca109細胞進行計數(shù)，以評估遷移能力。侵襲能力分析：首先將基質(zhì)膠以1∶2的比例用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋。在上腔室中，添加100 μL稀釋的基質(zhì)膠，37℃靜置1 h。后續(xù)步驟同遷移。

1.9實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測KTN1-AS1表達使用Trizol試劑提取細胞總RNA，PrimeScript RT試劑盒獲得互補DNA（cDNA），使用SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)，由2?ΔΔCt法計算KTN1-AS1相對于GAPDH的表達。KTN1-AS1引物序列：5'-ATGCA‐CACTTCTCGGCTAAGAGTC-3'（正向）和5'-CTA‐CAATGCCACAAGTGATTCCAGC-3'（反向），內(nèi)參GAPDH引物序列：5'-CCATGTTCGTCATGGGTGTG-3'（正向）和5'-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGTG-3'（反向）。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計，結(jié)果表示為±s。采用成組t檢驗比較兩組間數(shù)據(jù)差異，采用單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)差異，采用SNK法進行多組間兩兩比較。采用Spearman相關(guān)性分析檢驗相關(guān)性。P<0.05代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1薯莨提取物對食管癌細胞增殖的影響與對照組比較，10、20、30 mg/L薯莨提取物明顯增加Eca109細胞的抑制率，顯著降低細胞的克隆形成數(shù)，明顯提高P21蛋白水平（P<0.05），均呈濃度依賴性。Spearman相關(guān)性分析表明，食管癌細胞增殖的抑制率（r=0.564）、P21（r=0.517）與薯莨提取物濃度間存在正相關(guān)關(guān)系，克隆形成數(shù)（r=?0.498）與薯莨提取物濃度間存在負相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。見表1。

表1 薯莨提取物對食管癌細胞增殖的影響/±s

表1 薯莨提取物對食管癌細胞增殖的影響/±s

注：P21為周期素依賴激酶抑制劑p21。①與對照組比較，P<0.05。

組別對照組薯莨-L薯莨-M薯莨-H F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3抑制率/%1.06±0.21 19.25±1.68①38.57±3.69①62.14±6.06①154.81<0.001克隆形成數(shù)126.00±12.08 102.00±10.01①78.00±7.72①53.00±5.21①35.48<0.001 P21 0.16±0.01 0.30±0.03①0.49±0.05①0.67±0.07①70.71<0.001

2.2薯莨提取物對食管癌細胞遷移、侵襲的影響與對照組比較，10、20、30 mg/L薯莨提取物顯著減少Eca109細胞的遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)，明顯提高E-cadherin蛋白水平，而顯著降低MMP-2蛋白表達量（P<0.05），均呈濃度依賴性。Spearman相關(guān)性分析表明，食管癌遷移細胞數(shù)（r=?0.62）、侵襲細胞數(shù)（r=?0.55）、MMP-2（r=?0.64）與薯莨提取物濃度間存在負相關(guān)關(guān)系，E-cadherin（r=0.61）與薯莨提取物濃度間存在正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。見表2。

表2 薯莨提取物對食管癌細胞遷移、侵襲的影響/±s

表2 薯莨提取物對食管癌細胞遷移、侵襲的影響/±s

注：E-cadherin為上皮鈣黏素，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2。①與對照組比較，P<0.05。

組別對照組薯莨-L薯莨-M薯莨-H F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3遷移細胞數(shù)142.00±11.59 121.00±11.07①94.00±9.26①73.00±7.15①27.89<0.001侵襲細胞數(shù)81.00±8.03 67.00±6.21①50.00±5.04①37.00±3.56①31.54<0.001 E-cadherin 0.22±0.02 0.36±0.03①0.54±0.05①0.77±0.08①66.46<0.001 MMP-2 0.79±0.08 0.65±0.06①0.44±0.04①0.27±0.02①52.49<0.001

2.3薯莨提取物對食管癌細胞中KTN1-AS1表達的影響qRT-PCR檢測結(jié)果表明，對照組、薯莨-L組、薯莨-M組、薯莨-H組食管癌Eca109細胞中KTN1-AS1表達量分別為（1.00±0.10）、（0.78±0.07）、（0.54±0.05）、（0.30±0.03）（F=59.87，P<0.001）。與對照組比較，10、20、30 mg/L薯莨提取物顯著減少KTN1-AS1表達量（P<0.05），且呈濃度依賴性。Spearman相關(guān)性分析表明，食管癌細胞KTN1-AS1表達（r=?0.672）與薯莨提取物濃度間存在負相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。

2.4抑制KTN1-AS1對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響抑制KTN1-AS1對Eca109細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響如表3，圖1所示。在Eca109細胞中轉(zhuǎn)染si-KTN1-AS1，其表達量（0.41±0.04）顯 著 低 于si-NC組（1.01±0.10）（P<0.05），說明轉(zhuǎn)染有效。與si-NC組比較，抑制KTN1-AS1明顯增加Eca109細胞的抑制率、E-cadherin、P21蛋白表達量，顯著降低遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、克隆形成數(shù)和MMP-2蛋白水平（P<0.05）。

圖1 抑制KTN1反義RNA 1（KTN1-AS1）對食管癌細胞克隆形成數(shù)（1A）及遷移、侵襲（1B，結(jié)晶紫染色×200）的影響 圖2 過表達KTN1反義RNA 1（KTN1-AS1）能減弱薯莨提取物對食管癌細胞克隆形成數(shù)（2A）及遷移、侵襲（2B，結(jié)晶紫染色×200）的影響

表3 抑制KTN1反義RNA 1（KTN1-AS1）對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響/±s

表3 抑制KTN1反義RNA 1（KTN1-AS1）對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達的影響/±s

注：E-cadherin為上皮鈣黏素，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21。

組別si-NC si-KTN1-AS1 t值P值重復(fù)次數(shù)3 3遷移細胞數(shù)144.00±13.52 85.00±8.51 6.40 0.003侵襲細胞數(shù)80.00±8.11 47.00±4.36 6.21 0.003抑制率/%1.04±0.17 47.81±4.55 17.79<0.001克隆形成數(shù)124.00±12.01 70.00±7.04 6.72 0.003 E-cadherin 0.21±0.02 0.59±0.06 10.41 0.001 MMP-2 0.80±0.08 0.34±0.03 9.33 0.001 P21 0.18±0.02 0.51±0.05 10.61<0.001 KTN1-AS1 1.01±0.10 0.41±0.04 9.65 0.001

2.5過表達KTN1-AS1能減弱薯莨提取物對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響過表達KTN1-AS1在薯莨提取物誘導(dǎo)的Eca109細胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達中的作用如表4，5；圖2所示。與薯莨-H+pcDNA3.1組比較，薯莨-H+pcDNA3.1-KTN1-AS1組Eca109細胞中KTN1-AS1表達量、克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、MMP-2蛋白表達量明顯增加，抑制率、E-cadherin、P21蛋白水平顯著降低（P<0.05）。

表4 過表達KTN1反義RNA 1（KTN1-AS1）能減弱薯莨提取物對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響/±s

表4 過表達KTN1反義RNA 1（KTN1-AS1）能減弱薯莨提取物對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響/±s

組別薯莨-H+pcDNA3.1薯莨-H+pcDNA3.1-KTN1-AS1 t值P值重復(fù)次數(shù)3 3遷移細胞數(shù)72.00±7.18 122.00±12.05 6.17 0.004侵襲細胞數(shù)36.00±3.51 73.00±7.14 8.06 0.001抑制率/%62.07±6.18 14.37±1.15 13.14<0.001克隆形成數(shù)52.00±5.17 111.00±11.03 8.39 0.001

3 討論

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤，病人預(yù)后差。在我國，食管癌發(fā)病率高，是所有惡性腫瘤中第四常見的腫瘤［10］。另外，90%的食管癌為鱗狀細胞癌。雖然近年來食管癌的臨床診斷方法和治療方法有所改善，大多數(shù)食管癌病人由于早期缺乏預(yù)警癥狀而被診斷為晚期，不再適合手術(shù)治療。此外，約20%的病人在食管癌根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)［11］。根據(jù)報道，遠處轉(zhuǎn)移是病人預(yù)后不良的主要原因［12］。侵襲和轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是食管癌病人高病死率的根本原因。腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜過程，調(diào)控這一過程的分子機制尚不清楚［13］。因此，迫切需要了解食管癌侵襲和遷移的分子機制，并針對這種致命疾病開發(fā)新穎的預(yù)防和/或治療策略。

近年來，中醫(yī)藥在治療癌癥方面進行了大量有益的研究［14］。薯莨是我國傳統(tǒng)中藥，也是貴州少數(shù)民族常用藥，其化學(xué)成分豐富，含有鞣質(zhì)、酚類、糖類、苷類等活性成分［15］。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，薯莨及其提取物具有抗氧化、降壓、抗菌、抗輻射等功能［16-18］。資料顯示，薯莨提取物對食管癌Eca-109細胞、肝癌Huh-7細胞、胃癌AGS細胞、腎癌786-0細胞、肺癌A549細胞的增殖具有明顯抑制效果［5］，然而其對食管癌Eca-109細胞遷移和侵襲的作用及機制尚不明確。本實驗中，不同濃度的薯莨提取物明顯提高Eca109細胞的抑制率、P21、E-cadherin蛋白水平，并顯著減少細胞的克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、MMP-2蛋白表達量，均呈濃度依賴性，Spearman相關(guān)性分析表明，食管癌細胞增殖的抑制率、P21、克隆形成數(shù)、食管癌遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、E-cadherin與薯莨提取物濃度間均顯著相關(guān)，說明薯莨提取物擁有抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的活性，為食管癌的臨床治療藥物提供了有價值的參考。

表5 過表達KTN1-AS1能減弱薯莨提取物對食管癌細胞中E-cadherin、MMP-2、P21表達的影響/±s

表5 過表達KTN1-AS1能減弱薯莨提取物對食管癌細胞中E-cadherin、MMP-2、P21表達的影響/±s

注：KTN1-AS1為KTN1反義RNA 1，E-cadherin為上皮鈣黏素，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21。

組別薯莨-H+pcDNA3.1薯莨-H+pcDNA3.1-KTN1-AS1 t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 E-cadherin 0.75±0.07 0.34±0.03 9.33 0.001 MMP-2 0.28±0.03 0.61±0.06 8.52 0.001 P21 0.66±0.06 0.28±0.03 9.81 0.001 KTN1-AS1 0.31±0.03 0.84±0.08 10.74<0.001

新的證據(jù)表明，lncRNA可以參與多種生理和病理過程，影響不同的細胞功能，特別是在人類癌癥中［19］。值得注意的是，lncRNA作為腫瘤的促進或抑制因子來調(diào)節(jié)食管癌的生長和轉(zhuǎn)移，并可能作為食管癌等腫瘤的預(yù)測標(biāo)志物［20-22］。KTN1-AS1作為一種致癌lncRNA，與頭頸部鱗狀細胞癌病人的存活率顯著相關(guān)，可能成為一種準(zhǔn)確預(yù)測病人預(yù)后的新型生物標(biāo)志物［23］。然而KTN1-AS1在食管癌中的功能和意義仍然未知。本實驗對KTN1-AS1表達的檢測結(jié)果顯示，薯莨提取物以濃度依賴方式顯著減少Eca109細胞中KTN1-AS1的表達，猜想KTN1-AS1可能涉及薯莨提取物抑制食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用。功能實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制KTN1-AS1明顯增加Eca109細胞的抑制率、E-cadherin、P21蛋白表達量，顯著降低遷移細胞數(shù)、侵襲細胞數(shù)、克隆形成數(shù)和MMP-2蛋白水平，證實KTN1-AS1可能充當(dāng)食管癌的癌基因，抑制其表達可以顯著降低食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與前人研究［7-8］一致。對薯莨提取物作用機制的進一步考察發(fā)現(xiàn)，過表達KTN1-AS1減弱了薯莨提取物對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲的抑制效果，KTN1-AS1表達與薯莨提取物濃度間顯著相關(guān)，這些結(jié)果說明，薯莨提取物可能下調(diào)KTN1-AS1的表達，從而發(fā)揮食管癌的腫瘤抑制功能。

綜上所述，薯莨提取物可以抑制食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，顯示出一定的抗腫瘤活性，并且其抗食管癌的功能可能是通過調(diào)控KTN1-AS1的表達而實現(xiàn)的，表明薯莨具有作為預(yù)防和治療食管癌藥物的潛力，并且，KTN1-AS1可能是食管癌潛在的、有希望的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。