膽固醇7-羥化酶基因rs4738687多態性與乙型肝炎病毒感染的相關性研究

陳學兵，歐世梅，張利沙

乙型肝炎病毒（HBV）感染屬于全球性健康問題，研究發現目前世界范圍內近20億人感染過HBV，但是病人臨床結局存在較大差異，一般取決于HBV持續感染性以及病人康復狀態，HBV感染病人發生發展對于指導病人治療以及改善預后具有重要意義，因此如何有效的評價病人病情進展一直是臨床關注的熱點［1］。研究顯示宿主因素主要是宿主基因單核苷酸多態性是影響HBV感染與疾病發展的重要因素，既往研究發現鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白為肝細胞表面膽汁酸受體，也是HBV感染肝細胞受體，介導病毒進入到肝細胞，HBV則可以同膽汁酸競爭性結合，膽固醇7-羥化酶（cholesterol 7 alpha hydroxylase，CYP7A1）屬于膽汁酸生物合成途徑重要的限速酶，具有分解膽固醇變為膽汁酸能夠維持肝細胞脂質穩定的功能，有研究發現HBV能夠結合鈉離子-牛磺膽酸抑制膽汁酸進入到肝細胞，造成了該基因表達升高，促進了人體膽固醇轉變為膽汁酸導致肝細胞被破壞，但是臨床對于CYP7A1基因多態性對于HBV感染的相關性臨床分析極為少見［2］。本研究分析了CYP7A1基因rs4738687多態性與HBV感染的相關性，目的是分析該基因多態性同HBV病人臨床結局之間的關系，對HBV病人發病機制進行探討，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料回顧性選取2015年1月至2019年2月在德陽市人民醫院治療的HBV感染病人（觀察組），納入標準：①診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［3］中的標準；②入院前未接受抗病毒治療；③病人及近親屬知情同意。排除標準：①有其他病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等其他肝臟病變；②有HIV感染。最終納入200例（觀察組），其中慢性HBV感染者140例，HBV肝硬化病人60例。同時選取該院健康體檢者120例作為對照組，兩組一般資料比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》中的相關要求。

表1 觀察組（乙型肝炎病毒感染病人）和對照組（健康體檢者）一般資料比較

1.2實驗方法抽取病人空腹靜脈血3 mL，取200μL全血采用TIANamp基因組DNA試劑盒提取全血DNA，采用Haploview 4.2軟件對CYP7A1 rs4738687位點進行篩選，采用改進多重高溫連接酶檢測反應技術進行基因分型，PCR循環程序為95℃2 min，11個循環（94℃20 s，65℃每個循環遞減0.5℃40 s，72℃90 s）；72℃2 min后4℃60 min，在10μL PCR產物加入5單位蝦堿性磷酸酶及2單位核酸外切酶Ⅰ，37℃溫浴1 h，75℃滅活15 min。連接程序為38個循環（94℃1 min，56℃4 min），4℃60 min取0.5 μL稀釋后連接產物，同0.5μL Liz500 SIZE STAN‐DARD與9μL Hi-Di混勻后95℃變性5 min，采用ABI3730XL測序儀開展監測，利用GENEMapper 5.0生物系統分析并將最終結果輸出。

1.3統計學方法采用SPSS 22.0軟件，計量資料采用±s的形式表示。兩獨立樣本t檢驗分析組間差異；采用Hardy-Weinberg平衡規律檢驗樣本代表性；計數資料采用頻數或百分比的形式表示，χ2檢驗分析組間差異。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1CYP7A1基因rs4738687多態性CYP7A1基因rs4738687位點檢測出AA、GA和GG基因型，觀察組和對照組rs4738687位點多態性符合Hardy-Weinberg平衡規律。

2.2兩組rs4738687多態性比較觀察組和對照組rs4738687位點基因型和等位基因分布比較均差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 觀察組（乙型肝炎病毒感染病人）和對照組（健康體檢者）rs4738687多態性比較

2.3觀察組不同疾病病人rs4738687基因型及吸煙、飲酒情況比較觀察組HBV相關肝硬化病人rs4738687位點AG+GG基因型比例明顯高于慢性HBV感染病人（P<0.05）；慢性HBV感染和HBV相關肝硬化病人吸煙、飲酒比較均差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 觀察組［乙型肝炎病毒（HBV）感染病人］不同疾病病人rs4738687基因型及吸煙、飲酒情況比較/例（%）

2.4觀察組不同性別、年齡病人rs4738687基因型比較觀察組不同性別、年齡病人rs4738687位點AG+GG基因型比例比較均差異無統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 觀察組（乙型肝炎病毒感染病人）不同性別、年齡病人rs4738687基因型比較/例（%）

3 討論

乙型病毒性肝炎是臨床常見的肝臟傳染性疾病，我國流行病學調查顯示在1～4歲、5～14歲、15～29歲人群中HBV表面抗原流行率為0.32%、0.94%、4.38%，每年有近百萬人死亡于肝硬化、原發性肝癌等嚴重肝臟疾病，嚴重地影響了人們身心健康和生命質量［3-4］。HBV感染病人隨著病情不斷進展會逐漸發展為肝硬化，肝細胞廣泛變性、壞死，再生結節形成，結締組織增生，導致肝臟中的血液循環障礙，肝細胞營養障礙加重，門靜脈高壓、肝功能損害［5］。病理學研究發現HBV感染病人出現細胞外基質的異常沉積，肝星狀細胞發揮了主要的調節作用，一旦病人肝臟細胞受到損傷后，肝星狀細胞會大量增殖，促進了膠原合成，朝向成纖維細胞轉化，大量增生的纖維組織會重新分割包繞肝細胞，讓正常的肝小葉結構轉變成為肝硬化結節，因此慢性肝炎肝硬化均是肝細胞纖維化程度加重累積過程［6-7］。此外內質網應激誘導炎癥、凋亡和上皮細胞間質轉變屬于刺激因素參與到組織損傷和HBV感染發生發展過程中，目前臨床尋找診斷HBV感染特異性和敏感性的非創傷性指標極為重要，已有的血清學指標在評估肝纖維化程度時可能受到肝臟炎癥活動度影響［8-9］。

HBV感染病人病毒持續存在的原因尚不清晰，有報道指出即使同種族、性別及年齡相似的個體經同一種方式感染相同的病毒亞型，也會產生不同的后果，這提示了遺傳基因因素在慢性乙型肝炎中起著重要的作用［10-11］。本研究中重點分析了CYP7A1基因rs4738687多態性與HBV感染之間的關聯，CYP7A1是細胞色素P450酶，主要特異性存在人體肝臟微粒體，包含6個外顯子與5個內含子，也是人體催化膽固醇朝向膽汁酸轉化的第1步，屬于膽汁酸合成限速酶，膽固醇可以轉變為7α-羥膽固醇，膽固醇核還原、羥化等過程形成具有24碳初級膽汁酸與結合膽汁酸，可以反映人體膽汁酸合成的快慢［12-14］。研究顯示當人體出現膽汁淤積會導致膽汁酸代謝紊亂，造成肝細胞損傷與凋亡，嚴重的會發生壞死，而在HBV感染病人肝細胞中的CYP7A1會表達升高12倍，且同肝臟組織損傷嚴重程度呈現正相關性［15-17］。還有學者發現宿主因素特別是宿主基因單核苷酸多態性是導致HBV感染與疾病進展的重要因素，單核苷酸多態性可能會影響CYP7A1表達引發膽汁酸生成，造成肝臟不同程度炎癥反應［18-19］。本研究分析的rs4738687位點主要在該基因內含子，內含子突變會導致基因發生剪接，對基因表達發揮調控作用，有報道指出該位點的突變與近端大腸癌發病關系密切［20］。本研究觀察發現肝硬化病人AG+GG基因型比例顯著升高，提示該位點出現突變后可能會導致HBV感染病人疾病出現進展，而在性別與年齡分層發現，觀察組不同性別、年齡病人rs4738687位點AG+GG基因型比例比較差異無統計學意義，說明HBV感染病人CYP7A1基因rs4738687位點基因型與等位基因在性別與年齡分層方面不具有差別，但是由于本研究納入病人數量較少，尤其是女性病人的樣本含量還不夠大，可能導致各基因型分布比例偏差較大，需要擴充樣本量進一步驗證上述位點的意義。

本研究分析顯示CYP7A1基因rs4738687位點檢測出AA、GA和GG基因型，觀察組和對照組rs4738687位點多態性符合Hardy-Weinberg平衡規律，而且觀察組和對照組rs4738687位點基因型和等位基因分布比較差異無統計學意義，說明HBV感染病人CYP7A1基因rs4738687位點基因型與等位基因方面同健康人群差異無統計學意義。觀察組HBV肝硬化病人rs4738687位點AG+GG基因型比例明顯高于慢性HBV感染病人，說明肝硬化病人CYP7A1基因rs4738687位點AG+GG基因型比例顯著升高，也提示了上述位點發生突變后可能加速病人肝臟功能惡化，使HBV慢性感染發展為肝硬化。本研究的優勢在于提出了CYP7A1基因rs4738687多態性在HBV感染病人中的變化，為臨床研究國人HBV感染不同臨床結局遺傳基礎的認識，但是仍需開展多中心、多民族、大樣本、多基因的聯合分析，并進行相關功能學及感染機制的研究，為HBV感染的防控提供依據。

綜上述所，CYP7A1基因rs473868位點多態性與HBV感染易感性無明顯關系，但可能與HBV肝硬化發生存在正相關關系。