長鏈非編碼RNA FOXD2相鄰相反鏈RNA 1靶向調控微小RNA-760對前列腺癌細胞增殖和凋亡的影響

賈龍江，郝斌，許長寶，趙永立，馮國亮

前列腺癌是男性泌尿生殖系統惡性腫瘤，其易發生骨轉移，靶向治療是其新型治療方式［1］。潛在特異作用靶點是研發靶向藥物和臨床治療的難點。長鏈非編碼RNA（lncRNA）可在表觀遺傳、轉錄水平及轉錄后水平參與調控細胞生理過程，研究報道多種lncRNA的異常表達與前列腺癌的進展密切相關［2］。FOXD2相鄰相反鏈RNA 1（FOXD2-AS1）是FOXD2的反義RNA1，一種lncRNA，研究發現FOXD2-AS1可通過調節EMT和Notch信號通路促進結腸癌的進展［3］。FOXD2-AS1在鼻咽癌組織和細胞中高表達，與病人預后不良相關［4］。微小RNA（miRNA）參與細胞周期調控、凋亡和分化等過程，與前列腺癌的發生和發展密切相關［5］。研究發現過表達miR-760可通過整合素β3/細胞周期蛋白D1（integrinβ3/cyclin D1）信號抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲［6］；過表達miR-760還可以抑制胃癌MGC-803細胞的遷移和侵襲［7］。然而FOXD2-AS1和miR-760在前列腺癌細胞中的表達及相互關系目前尚未可知。本實驗研究FOXD2-AS1和miR-760對前列腺癌細胞增殖、凋亡的分子機制，為前列腺癌的分子靶向治療提供參考。實驗于2019年1—11月進行。

1 材料與方法

1.1材料正常前列腺上皮細胞株RWPE-1和前列腺癌細胞株DU145、LNCaP、22Rv1由中國科學院上海細胞庫提供；胎牛血清、RPMI-1640培養基、胰蛋白酶由美國Gibico公司提供；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、LipofectamineTM2000轉染試劑盒由美國ABI公司提供；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、BCA試劑盒由Sigma公司提供；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、電化學發光（ECL）液、放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒由上海碧云天生物技術有限公司提供；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒由上海美軒生物科技有限公司提供；載體質粒由上海基屹生物科技有限公司提供；抗體均由北京博奧森生物科技有限公司提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將正常前列腺上皮細胞株RWPE-1和前列腺癌細胞株DU145、LNCaP、22Rv1接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，并常規在37℃、5%二氧化碳培養箱中培養、傳代。

1.2.2細胞轉染與分組 取對數生長期細胞DU145無血清培養12 h后，將空載體質粒（pcDNA）、FOXD2-AS1過表達質粒（pcDNA-FOXD2-AS1）、小干擾RNA陰性對照（si-NC）、FOXD2-AS1小干擾RNA（si-FOXD2-AS1）、miR-760陰 性 對 照（miRNC）、miR-760及si-FOXD2-AS1+抗miR-760陰性對照（anti-miR-NC）、si-FOXD2-AS1+抗miR-760（antimiR-760）質粒轉染至細胞DU145中，于轉染48 h進行實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）驗證無誤后再進行后續相關實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-760和FOXD2-AS表達水平 收集轉染驗證后的DU145細胞，嚴格按照RNA抽提及逆轉錄相關試劑盒說明書提取總RNA，并快速將其逆轉錄為互補DNA（cDNA）。嚴格依據qRT-PCR說明書分別以U6和GAPDH為內參進行miR-760和FOXD2-AS1檢測。每個樣品設3個復孔，反應體系終體積為20μL，其中逆轉錄產物2μL，SYBR Green Mix 10μL，正反向引物各1μL，水6μL；反應條件為95℃30 s，60℃30 s；72℃45 s，共40個循環；72℃延長5 min。采用2?ΔΔCt法計算miR-760和FOXD2-AS1的相對表達量。miR-760正向引物序列：5'-GTCGAGCGGCTCTGGGTCTGTG-3'，反向引物序列：5'-TCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；FOXD2-AS1正 向 引 物 序 列：5'-CCGCGTA‐AGCCTCATAGAAG-3'，反向引物序列：5'-GGGAG‐TAGGGTGAGGAAAGG-3'；U6正向引物序列：5'-TACGAGTGCTCACTTCGGCAGC-3'，反向引物序列：5'-GTCCTTCCTGCCGAGTG-3'；GAPDH正向引物序列：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，GAPDH反向引物序列：5'-CAAAGTTGTCATGGATGCACC-3'。

1.2.4熒光素酶報告實驗檢測FOXD2-AS1對miR-760的靶向調控 根據“1.2.2”方法完成DU145細胞培養及轉染。FOXD2-AS1野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1，設計擴增WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1片段的引物序列，分別在結合位點的上游和下游設計引物并添加酶切位點，其中，FOXD2-AS1野生型引物中序列包含GGUGCAGAGCC，突變型引物序列中將GGUGCAGAGCC替換為TGTGACAGCGT，通過PCR擴增片段并酶切回收，而后添加到雙熒光素酶報告載體中，由上海基屹生物科技有限公司構建合成。將WT-FOXD2-AS1和MUT-FOXD2-AS1載體分別與miR-NC和miR-760對DU145細胞進行共轉染。嚴格按照相關說明書進行熒光素酶和Renilla活性的檢測。重復實驗3次。

1.2.5蛋白質印跡法檢測蛋白表達 按試劑使用說明常規進行各蛋白的提取、電泳、封閉、一抗及二抗孵育、顯色；成像后用Image J軟件進行數字化信息轉化，分析各蛋白條帶的灰度水平，各蛋白樣品均設3個復孔，并重復實驗3次。

1.2.6MTT法檢測細胞增殖 于各組細胞培養24、48、72 h時，每孔分別加入MTT（5 g/L）溶液20μL，繼續在培養箱中孵育4 h后去除上清液，并在每孔中加入150μL DMSO，常溫振蕩10 min以溶解沉淀，用酶標儀檢測490 nm處吸光度。細胞增殖活力（%）=實驗組吸光度/空白對照組吸光度×100%。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡 各組DU145細胞培養48 h后用PBS清洗2次，與500μL的結合緩沖液混勻。先加入10μL的膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），再加入5μL的碘化丙啶（PI），混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀嚴格依據凋亡檢測試劑盒說明書進行細胞凋亡率檢測。每組設3個復孔，并重復實驗3次。

1.3統計學方法用SPSS 20.00軟件進行統計。計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析及多組間兩兩比較的SNK法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1FOXD2-AS1和miR-760在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的表達與正常前列腺上皮細胞RWPE-1相比，前列腺癌細胞DU145、LNCaP、22Rv1中FOXD2-AS1表達水平顯著升高（P<0.001），miR-760表達水平顯著降低（P<0.001）（表1）。

表1 FOXD2-AS1和miR-760在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的表達/±s

表1 FOXD2-AS1和miR-760在前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞中的表達/±s

注：FOXD2-AS1為FOXD2相鄰相反鏈RNA 1。①與RWPE-1組比較，P<0.001。

組別RWPE-1 DU145 LNCaP 22Rv1 F值P值重復次數9 9 9 9 FOXD2-AS1 1.00±0.09 2.45±0.24①2.13±0.21①2.28±0.23①95.36<0.001 miR-760 1.01±0.08 0.42±0.04①0.56±0.05①0.34±0.03①282.61<0.001

2.2FOXD2-AS1靶向調控miR-760的表達通過TargetScan數據庫預測到FOXD2-AS1與miR-760存在結合位點（圖1）。熒光素酶報告結果顯示，轉染野生型和突變型FOXD2-AS1基因表達載體WTFOXD2-AS1、MUT-FOXD2-AS1后，與miR-NC組相比，miR-760組WT-FOXD2-AS1前列腺癌細胞DU145熒光素酶活性顯著降低［（0.42±0.03）比（1.04±0.09）］（t=19.606，P<0.001）；而MUT-FOXD2-AS1前列腺癌細胞DU145的熒光素酶活性［（1.02±0.09）比（1.03±0.08）］差異無統計學意義（t=0.249，P=0.806）。qRT-PCR檢測結果顯示，與pcDNA組相比，pcDNA-FOXD2-AS1組DU145細胞中miR-760的表達水平顯著降低［（0.45±0.04）比（1.02±0.09）］（t=17.362，P<0.001）；與si-NC組相比，si-FOXD2-AS1組DU145細胞中miR-760表達水平顯著升高［（2.34±0.23）比（1.01±0.08）］（t=16.385，P<0.001）。可見，FOXD2-AS1可靶向調控miR-760的表達。

圖1 FOXD2相鄰相反鏈RNA 1（FOXD2-AS1）的序列中含有與miR-760互補的核苷酸序列

2.3抑制FOXD2-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的影響與si-NC組相比，si-FOXD2-AS1組FOXD2-AS1、cyclin D1、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達水平顯著降低，周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P<0.001）（表2）。可見，抑制FOXD2-AS1表達抑制前列腺癌DU145細胞增殖，促進細胞凋亡。

表2 抑制FOXD2相鄰相反鏈RNA 1（FOXD2-AS1）表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的影響/±s

表2 抑制FOXD2相鄰相反鏈RNA 1（FOXD2-AS1）表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的影響/±s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。

組別si-NC si-FOXD2-AS1 t值P值重復次數9 9 FOXD2-AS1 1.00±0.08 0.39±0.04 20.46<0.001 490 nm處吸光度（增殖）24 h 0.41±0.04 0.38±0.03 1.80 0.091 48 h 0.76±0.06 0.49±0.04 11.23<0.001 72 h 1.14±0.09 0.62±0.06 14.42<0.001凋亡率/%7.42±0.73 21.56±2.08 19.24<0.001 cyclin D1蛋白0.63±0.06 0.24±0.03 17.44<0.001 P21蛋白0.33±0.03 0.74±0.07 16.15<0.001 Bcl-2蛋白0.69±0.06 0.29±0.03 17.89<0.001 Bax 0.21±0.03 0.59±0.05 19.55<0.001

2.4miR-760過表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的影響與miR-NC組相比，miR-760組cy‐clin D1、Bcl-2表達水平顯著降低，miR-760、P21、Bax表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P<0.001）（圖2，表3）。可見，miR-760過表達抑制DU145細胞增殖，促進細胞凋亡。

表3 miR-760過表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的影響/±s

表3 miR-760過表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的影響/±s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。

組別miR-NC miR-760 t值P值重復次數9 9 miR-760 1.01±0.08 2.33±0.23 16.26<0.001 490 nm處吸光度（增殖）24 h 0.39±0.04 0.38±0.03 0.60 0.557 48 h 0.71±0.06 0.54±0.05 6.53<0.001 72 h 1.13±0.09 0.69±0.06 12.20<0.001凋亡率/%6.58±0.64 18.45±1.82 18.46<0.001 cyclin D1蛋白0.65±0.06 0.28±0.03 16.54<0.001 P21蛋白0.32±0.03 0.71±0.07 15.36<0.001 Bcl-2蛋白0.68±0.06 0.31±0.03 16.55<0.001 Bax 0.22±0.03 0.56±0.05 14.49<0.001

圖2 miR-760過表達對前列腺癌DU145細胞增殖、凋亡相關蛋白的影響

2.5下調miR-760表達逆轉了抑制FOXD2-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的作用與si-NC組相比，si-FOXD2-AS1組cyclin D1、Bcl-2表達水平顯著降低，miR-760、P21、Bax表達水平顯著升高，細胞活性顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P<0.001）；與si-FOXD2-AS1+anti-miR-NC組相比，si-FOXD2-AS1+anti-miR-760組cyclin D1、Bcl-2表達水平顯著升高，miR-760、P21、Bax表達水平顯著降低，細胞活性顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P<0.001）（表4）。可見，下調miR-760表達逆轉了抑制FOXD2-AS1表達對DU145細胞增殖抑制和凋亡促進的作用。

表4 下調miR-760表達逆轉了抑制FOXD2-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的作用/±s

表4 下調miR-760表達逆轉了抑制FOXD2-AS1表達對前列腺癌DU145細胞增殖和凋亡的作用/±s

注：cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白。①與si-NC組比較，P<0.05。②與si-FOXD2-AS1+anti-miR-NC組比較，P<0.05。

組別si-NC si-FOXD2-AS1 si-FOXD2-AS1+anti-miR-NC si-FOXD2-AS1+anti-miR-760 F值P值重復次數9 9 9 9 miR-760 1.02±0.09 2.41±0.24①2.46±0.25 1.53±0.15②117.60<0.001 490 nm處吸光度（增殖）24 h 0.39±0.03 0.36±0.03 0.35±0.03 0.38±0.04 2.79 0.056 48 h 0.72±0.07 0.48±0.04①0.46±0.04 0.61±0.05②50.12<0.001 72 h 1.12±0.09 0.71±0.06①0.66±0.05 0.89±0.08②75.79<0.001凋亡率/%8.32±0.81 20.36±2.07①21.48±2.14 11.87±1.16②137.06<0.001 cyclin D1蛋白0.66±0.06 0.26±0.03①0.24±0.03 0.54±0.05②197.32<0.001 P21蛋白0.34±0.03 0.75±0.05①0.76±0.07 0.46±0.04②161.55<0.001 Bcl-2蛋白0.71±0.06 0.28±0.03①0.27±0.03 0.59±0.05②224.62<0.001 Bax 0.20±0.03 0.57±0.05①0.58±0.06 0.32±0.03②161.73<0.001

3 討論

前列腺癌惡性度高，發病機制復雜，研究前列腺癌發病機制對其診斷及治療、預后及療效評價具有重要臨床意義［8-10］。研究發現lncRNA調節前列腺癌生物學過程，與前列腺癌的復發、轉移和預后密切相關［11-12］。有研究報道FOXD2-AS1通過靶向miR-206增強了肝細胞癌細胞的活力和轉移，在肝細胞癌中發揮致癌作用［13］。FOXD2-AS1在卵巢癌中高表達，下調FOXD2-AS1通過調控miR-150-5p表達抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移［14］。本研究結果顯示，前列腺癌細胞中FOXD2-AS1表達水平顯著升高，抑制FOXD2-AS1表達能使DU145細胞活性降低，細胞凋亡率顯著升高；說明通過抑制FOXD2-AS1表達可以抑制DU145細胞增殖，并促進細胞凋亡。此外，抑制FOXD2-AS1表達還能抑制Bcl-2、cyclin D1蛋白的表達，促進Bax、P21蛋白的表達。

研究表明miRNA參與腫瘤的增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程［15-17］。有報道顯示miR-760在結直腸癌中低表達，可通過靶向上調EphB3表達，促進結直腸癌細胞增殖、遷移［18］。還有研究發現過表達miR-760可抑制人乳腺癌細胞增殖與遷移［19］。miR-760還能抑制非小細胞肺癌的增殖和轉移［20］。本研究顯示，前列腺癌細胞中miR-760表達水平顯著降低，過表達miR-760，DU145細胞活性降低，細胞凋亡率顯著升高；說明miR-760過表達能抑制DU145細胞增殖，并促進細胞凋亡。此外，過表達miR-760還抑制Bcl-2、cyclin D1蛋白的表達，促進Bax、P21蛋白的表達。本研究還發現FOXD2-AS1靶向調控miR-760的表達，抑制miR-760過表達逆轉了抑制FOXD2-AS1對前列腺癌細胞DU145增殖抑制和凋亡促進作用。說明FOXD2-AS1可能通過調控miR-760影響前列腺癌細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，lncRNA FOXD2-AS1可能通過靶向miR-760抑制前列腺癌細胞DU145的增殖、促進其凋亡，可為前列腺癌的預防和治療提供新靶點。