肝細胞癌的細胞分裂周期基因20表達與臨床病理特征關系及對預后的影響

宋應周，孟松峰

肝細胞癌在全球肝臟惡性腫瘤中發病率呈上升趨勢，已成為癌癥死亡的第二大誘因［1］。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒慢性感染、肝硬化、酒精性肝病和黃曲霉毒素等造成了肝細胞癌的高發病率［2-4］。然而，促進肝癌發病機制仍不清楚。在肝細胞癌發生過程中，細胞周期檢查點的改變可能與癌癥形成密切相關［5］。細胞分裂周期基因20（CDC20）是細胞周期檢查點的調節劑，與細胞周期后期中復合物/環體相互作用的調節蛋白和有絲分裂相關［6］。CDC20可與APC結合并在有絲分裂和G1期激活細胞周期蛋白的泛素化活性，促進細胞增殖［7］。CDC20可通過調節細胞周期、促進細胞凋亡，抑制惡性轉化［8］。研究表明，多種癌癥中CDC20的高表達，與腫瘤的增殖、侵襲及不良預后有關［9-12］。然而，CDC20在肝細胞癌中的研究較少，該研究通過檢測肝細胞癌組織中CDC20的水平，分析CDC20的表達與病人臨床病理特征的關系及對預后的影響，為肝細胞癌的預后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2016年5月至2017年12月在商丘市第三人民醫院行手術治療的肝細胞癌病人146例，男115例，女31例，年齡范圍為38～62歲，收集病人的臨床資料。收集手術切除的肝細胞癌組織及對應的癌旁組織，放置于?80℃超低溫冰箱中。術后采用電話的方式定期隨訪，最短隨訪時間5個月，最長隨訪時間36個月，隨訪截止日期為2020年12月1日，146例的臨床資料及隨訪資料完整。該研究經商丘市第三人民醫院倫理委員會批準（20160412），病人或其近親屬同意并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR） qRT-PCR檢測肝細胞癌組織中CDC20mRNA的表達。組織中的總RNA根據Trizol試劑盒進行提取。提取的RNA逆轉錄為互補DNA（cD‐NA），進行實時熒光定量PCR。CDC20正向引物序列5′-TCGAAGTCACTCGGTAGCGT-3′，反向引物序列5′-GATCCTGCATACTGCTTGCA-3′；U6正向引物序 列5′-GGCCTCATCCTCATCATGGCAGUAG-3′，反向引物序列5′-AGCCAGATGCCTAGCGACGTGC‐GC-3′。總反應體系為20μL，反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環。以管家基因U6 mRNA水平作為內參照，采用2?ΔΔCt法計算CDC20 mRNA的相對表達水平。

1.2.2蛋白質印跡法 蛋白質印跡法檢測肝細胞癌組織中CDC20的表達。取組織中的總蛋白，根據BCA蛋白定量試劑盒取30μg的蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳凝膠上的蛋白濕轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，PVDF膜放置含有1%BSA的盒子中，孵育2 h、之后經過一抗孵育（1∶1 000稀釋，4℃過夜）、TBST洗滌3次、二抗孵育（1∶4 000稀釋，室溫1 h）、TBST洗滌3次后，在PVDF膜上滴加適量化學發光顯色液，在凝膠成像系統中拍照，根據灰度值估測CDC20蛋白表達水平。

1.2.3免疫組織化學實驗 免疫組織化學檢測肝細胞癌組織中CDC20的表達。切制冷凍切片，經過脫蠟和梯度乙醇水化處理后，利用PV6000法染色，加入3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶。置于修復液中，加熱行抗原進行修復，然后放置室溫自然冷卻。經封閉后，滴加一抗（1∶200），置于4℃冰箱孵育過夜。利用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，滴加相應種屬二抗（1∶400），室溫下孵育60 min，并用PBS進行3遍沖洗。滴加新鮮配制的顯色液，利用蘇木素染料復染，中性樹膠封固，最后置于顯微鏡下觀察。染色強度評分：強陽性、中等陽性、弱陽性和陰性評分分別為3分、2分、1分和0分，陽性細胞數的評分：>75%～100%、>50%～75%、>25%～50%、5%～25%和<5%評分分別為4分、3分、2分、1分和0分，染色強度評分和陽性細胞數的評分的乘積即為總分，0～7分為低水平，8～12分為高水平。

1.3統計學方法應用SPSS 21.0軟件行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用配對t檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，多組間的兩兩比較檢驗水準α=0.016；采用Kaplan-Meier法繪制疾病無進展生存率和總生存率曲線，log-rank檢驗比較不同組間的生存率。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1qRT-PCR檢測肝細胞癌組織中CDC20mRNA的表達CDC20 mRNA在肝細胞癌組織表達水平（2.33±0.67）高于對應的癌旁組織（0.97±0.29）（t=5.95，P<0.001）。

2.2蛋白質印跡法檢測肝細胞癌組織中CDC20的表達CDC20蛋白在肝細胞癌組織中相對表達水平（0.91±0.05）高于對應的癌旁組織（0.14±0.05）（t=34.30，P<0.001）。

2.3免疫組織化學檢測肝細胞癌組織中CDC20的表達CDC20在肝細胞癌陽性表達率（77.4%，113/146）高于對應癌旁組織（8.2%，12/146），差異有統計學意義（χ2=142.69，P<0.001）。見圖1（僅展示3例病人的結果）。

圖1 細胞分裂周期基因 20（CDC20）在3例肝細胞癌組織中的表達情況（免疫組織化學×200）

2.4CDC20表達與病人臨床病理特征的關系CDC20的表達與病人的腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發、分化程度和TNM分期有關（P<0.05），見表1。

表1 細胞分裂周期基因20（CDC20）表達水平與肝細胞癌病人臨床病理特征的關系/例（%）

2.5CDC20表達對病人術后生存率的影響CDC20高水平組總生存率為（61.7%）和疾病無進展生存率（50.0%）均低于CDC20低水平組（87.2%、69.8%）（log-rankχ2=14.19，P<0.001；log-rankχ2=9.61，P=0.005）。

3 討論

肝細胞癌是常見的惡性腫瘤，在過去的20年中，觀察到與肝細胞癌相關的年死亡率顯著增加［13-14］。此外，根據美國國立癌癥研究所“監測、流行病學和結果數據庫”SEER注冊機構項目研究，到2030年肝細胞癌的發病率將繼續上升［15］。準確估計預后，在肝細胞癌治療中起著至關重要的作用。尋找預測肝細胞癌預后的生物標志物具有重要的臨床價值。許多CDC20底物都參與有絲分裂過程，包括細胞周期蛋白B1、細胞周期蛋白A、分離酶抑制蛋白（Securin）、雙能蛋白（Geminin）和周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）［16］。最近，越來越多的研究顯示CDC20在人類癌癥中起致癌作用，在多種人類腫瘤中觀察到CDC20的過度表達，與生存率降低有關［17］。

CDC20在結直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌中的表達均增加［9-12］，在該研究中，肝細胞癌組織中CDC20 mRNA和蛋白質水平均高于癌旁組織，提示CDC20促進肝細胞癌的發生發展。目前多項研究顯示，CDC20高水平參與多種腫瘤的進展，例如Kim等［12］研究顯示，CDC20在腸化生、低度不典型增生、高度不典型增生和早期胃癌中的表達明顯高于正常黏膜，且在高度不典型增生中的表達水平最高，且CDC20過表達與胃癌病人的年齡、腸道組織學、較低的腫瘤-淋巴結-轉移階段以及較長的無復發生存期和癌癥特異性生存期相關。CDC20與前列腺癌的惡性進展相關，CDC20高水平病人更具侵略性的臨床病理特征和不良預后［11］。Li等［18］證明了膀胱尿路上皮癌病例中CDC20升高，而CDC20高水平與病人的無復發生存期較短和總體生存期較差相關。該研究中，CDC20在肝細胞癌中的表達水平與腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發、分化程度和TNM分期有關，說明在腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發分化程度低和TNM晚期的病人中CDC20的表達水平更高。提示CDC20可能與肝細胞癌的增殖與侵襲有關，CDC20高水平的肝細胞癌病人具有較強的增殖活性和更強的侵襲能力，與肝細胞癌的發展密切相關。在該研究中，CDC20高水平病人的術后3年總生存率和疾病無進展生存率均較低，提示CDC20有可能成為評價肝細胞癌預后的有效標志物。CDC20促進肝細胞癌的進展，其失活可能對治療肝細胞癌有一定療效。目前已發現幾種CDC20抑制劑，例如類毒素-抗毒素混合物酯酶、pro-TAME和2-［芐基-（2-硝基-苯磺酰基）-氨基］-N-羥基-3-甲基-N-丙基-丁酰胺［19-20］。對CDC20抑制劑的研究可能有助于闡明CDC20在人類癌癥中的作用機制，這也是后期該研究的方向之一。

綜上所述，CDC20在肝細胞癌中的表達水平增加，可能參與腫瘤的增殖和侵襲。CDC20高水平預示病人的預后不良，有望成為判斷肝細胞癌預后的腫瘤標志物。