長鏈非編碼RNA變異性漿細胞瘤異位1通過調控微小RNA-214-3p/人凋亡抑制蛋白X軸影響皮膚黑色素瘤細胞的順鉑耐藥性

胡珍，吳庭，孫弦，劉睿

皮膚黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）是來源于黑色素細胞的皮膚惡性腫瘤，發病隱匿且易轉移，近年來其發病率呈逐年上升趨勢，給人類健康帶來嚴重威脅［1］。目前，CMM的主要治療手段是手術、放化療等。順鉑（DDP）是一線化療藥物，抗腫瘤作用已被廣泛認可，但由于黑色素細胞易形成耐藥性，極大地影響了CMM的治療效果及DDP的應用［2-3］。因此，深入探討CMM化療耐藥相關基因及其分子調控相關機制，對尋找新型CMM化療耐藥分子靶點有較大意義。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一種反義RNA分子，不具有蛋白編碼能力，能與靶基因非編碼區特異性結合，調節基因轉錄和表達而發揮促癌或抑癌作用［4］。變異性漿細胞瘤異位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是lncRNAs家族一員，既往研究顯示，其在CMM病人癌組織中異常高表達，且體外研究表明抑制其表達后能顯著抑制CMM細胞活性，促進細胞凋亡［5］。抑制PVT1可顯著抑制結直腸癌耐藥細胞株LoVo/DDP的增殖，增加其化療敏感性［6］。微小RNA（microRNA，miRNA/miR）是一類非編碼RNA，調節基因轉錄、表達，參與多種生理活動［7］。miR-214-3p作為常見的miRNA，被證實參與調控癌細胞活性［8］，PVT1在乳腺癌組織中特異性高表達，降低miR-214的表達可增加乳腺癌細胞化療耐藥性。研究顯示，過表達miR-214-3p可顯著抑制肺癌細胞存活能力及多藥耐藥性［9］。目前，有關PVT1、miR-214-3p對CMM細胞DDP耐藥性的影響及相關機制研究鮮有報道，因此本研究于2020年3—9月探討PVT1與miR-214-3p對CMM耐藥細胞生物學行為的影響，以期為臨床尋找新型CMM化療耐藥分子靶點提高化療效果提供一定參考。

1 材料與方法

1.1材料人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1細胞株（BNCC100491）購自北納創聯（北京）生物技術研究院。RPMI培養基（3-2001）、蛋白提取試劑盒（BC3711-50T）、轉染試劑盒（LipofectamineTM3000，EF010-E）購自美國艾美捷；3-2（4，5-二甲基噻唑-2）-2-四甲基偶氮噻唑藍（MTT）（CS2905）、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（WK304）、核酸分離試劑（Trizol Reagent，YT526）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（KFS303-HUV）購自北京百奧萊博；兔抗人凋亡抑制蛋白X（XIAP）（201477-T36）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）（ATA25287）、細胞增殖相關核抗原Ki-67（100130-MM21）、B細 胞 淋巴 瘤-2（Bcl-2）（FT-B3598S）、β肌動蛋白（β-actin）（ABP57456）一抗、辣根過氧化物酶（HRP）（羊抗兔，SE12-0.1）二抗均購自武漢益普生物；注射用順鉑（凍干型）（貨號C14330-100mg，規格10 mg）購自山東齊魯制藥。PVT1-inhibitor及miR-214-3p-inhibitor購自上海吉瑪。BBD6220培養箱購自美國ThermoFisher Scien‐tific；ELx800酶標儀、C1000定量PCR儀購自美國Bio-rad；CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman。

1.2方法

1.2.1細胞培養 細胞株解凍后復蘇，加入含10%胎牛血清的RPMI培養基中，培養箱中培養（5%二氧化碳，37℃，飽和濕度），每2～3天換液，傳代培養，利用DDP濃度梯度法建立DDP耐藥細胞株SK-MEL-1/DDP細胞，以5.33 mg/L DDP溶液維持細胞耐藥性，在正式實驗前1周更換不含DDP的培養液培養。

1.2.2細胞分組及處理 取對數生長期細胞株重懸，接種于24孔板（2.5×105個/孔），分為四組。（1）空白對照組（NG組）：只含SK-MEL-1/DDP細胞，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養48 h；（2）陰性轉染組（NC組）：加入5μL LipofectamineTM3000和50μmol/L PVT1-inhibitor-NC，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養48 h；（3）抑制PVT1表達組（PVT1-inhibitor組）：加入5μL LipofectamineTM3000和50μmol/L PVT1-inhibitor序列，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養48 h；（4）共轉染組（PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組）：加入5 μL LipofectamineTM3000和50μmol/L PVT1-inhibitor及miR-214-3p-inhibitor序列共轉染后，用含10%滅活胎牛血清+90%RPMI培液培養48 h。嚴格按照轉染試劑盒說明書操作，收集各組細胞用于后續實驗。PVT1-inhibitor序列：5′-ACTTTAAGTGGAG‐GCTGAATCATCT-3′，miR-214-3p-inhibitor序 列：5′-ACUGCCUGUCUGUGCCUGCUGU-3′。

1.2.3實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRTPCR）檢測lncRNA PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平 TRIzol法提取培養48 h的細胞株總RNA，測定濃度。按照試劑盒說明書方法逆轉錄合成互補DNA（cDNA）。引物由蘇州泓迅生物設計合成。2?ΔΔCt方法計算PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平相對表達量。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖能力及耐藥性 取轉染48 h后的細胞株接種于24孔板（2.5×104個/孔），每組6個復孔。細胞增殖能力檢測：各組細胞均繼續培養48 h后向各孔加入MTT 20μL，加入150μL二甲基亞砜振蕩。在酶標儀490 nm處測定各孔細胞光密度。計算細胞增殖抑制率（%）=（1?實驗組光密度值/對照組光密度值）×100%。耐藥性檢測：各組細胞分別加入0、2、4、8、16、32、64μg/L DDP溶液［10］，100毫升/孔，繼續培養48 h，其余操作同細胞增殖能力測定方法。計算細胞增殖抑制率且用線性回歸法計算藥物半數抑制濃度（IC50）值。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 取轉染48 h后的細胞株接種于24孔板（2.5×105個/孔），按照試劑盒說明書處理細胞，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后離心棄上清，PBS混勻沉淀，70%乙醇4℃固定24h。PBS清洗，加5μL PI+5μL AnnexinV‐FITC混勻，染色30 min、稀釋后上機檢測。

1.2.6蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 裂解細胞并提取總蛋白，電泳分離蛋白后轉膜，以脫脂牛奶（5%）封閉，加入一抗Ki-67、Bcl-2、Bax、XIAP（1∶500），4℃過夜，清洗，加入二抗（1∶1 000）孵育1 h。顯色、成像。分析蛋白含量。

1.2.7雙熒光素酶報告基因檢測PVT1對miR-214-3p的轉錄調控 TargetScan預測PVT1與miR-214-3p存在結合位點，擴增序列后構建含miR-214-3p結合位點的PVT1基因克隆載體，構建PVT1野生型質粒（PVT1-WT）和突變型質粒（PVT1-MT）。將PVT1-WT、PVT1-MT分別與miR-214-3p-inhibitor-NC、miR-214-3p-inhibitor共轉染于SK-MEL-1/DDP細胞，分別為miR-214-3p-inhibitor-NC-PVT1-WT組、miR-214-3p-inhibitor-PVT1-WT組、miR-214-3p-inhibitor-NCPVT1-MT組、miR-214-3p-inhibitor-PVT1-MT組，具體轉染步驟按“1.2.2”中進行；培養48 h后按照試劑盒方法，檢測熒光素酶相對活性。

1.3統計學方法軟件SPSS19.0分析數據。數據以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平比較與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、XIAP mRNA水平顯著降低（P<0.05），miR-214-3p顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibi‐tor+miR-214-3p-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1水平差異無統計學意義（P>0.05），miR-214-3p水平顯著降低（P<0.05），XIAPmRNA水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表2 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平比較/±s

表2 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞PVT1、miR-214-3p、XIAPmRNA水平比較/±s

注：PVT1為變異性漿細胞瘤異位1，β-actin為β-肌動蛋白，XIAP為人凋亡抑制蛋白X。①與NG組比較，P<0.05。②與NC組比較，P<0.05。③與PVT1-inhibitor組比較，P<0.05。

組別NG組NC組PVT1-inhibitor組PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組F值P值重復次數6 6 6 6 PVT1/β-actin 0.99±0.15 1.00±0.15 0.55±0.08①②0.53±0.07①②29.45<0.001 miR-214-3p/U6 1.02±0.15 1.01±0.16 1.45±0.21①②1.20±0.18①②③8.18<0.001 XIAPmRNA 1.00±0.15 1.02±0.15 0.53±0.08①②0.85±0.13①②③18.02<0.001

2.2各組SK-MEL-1/DDP細胞增殖情況比較NG組［（0.00±0.00）%］、NC組［（0.08±0.01）%］、PVT1-in‐hibitor組［（22.87±3.43）%］及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組［（15.12±2.27）%］SK-MEL-1/DDP細胞增殖抑制率比較，F=184.10，P<0.001；與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3pinhibitor組顯著降低（P<0.05）。

表1 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）引物序列

2.3各組SK-MEL-1/DDP細胞對DDP耐藥性比較NG組［（45.03±1.35）μg/L］、NC組［（47.81±1.33）μg/L］、PVT1-inhibitor組［（15.13±0.45）μg/L］及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組［（23.98±0.72）μg/L］SK-MEL-1/DDP細胞IC50比較，差異有統計學意義（F=1 418.74，P<0.001）；與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組顯著降低（P<0.05）；與PVT1-in‐hibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組顯著升高（P<0.05）。

2.4各組SK-MEL-1/DDP細胞凋亡情況比較NG組［（15.69±2.35）%］、NC組［（17.01±2.55）%］、PVT1-inhibitor組［（40.05±6.06）%］及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組［（27.88±4.19）%］SK-MEL-1/DDP細胞凋亡率比較，F=46.48，P<0.001；與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibi‐tor組顯著降低（P<0.05）。

2.5各組SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞Ki-67、Bcl-2蛋白顯著降低（P<0.05），Bax顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組SKMEL-1/DDP細胞Ki-67、Bcl-2蛋白顯著升高（P<0.05），Bax顯著降低（P<0.05）。見圖1，表3。

表3 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較/±s

表3 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較/±s

注：Ki-67為細胞增殖相關核抗原，Bax為Bcl-2相關X蛋白，β-actin為β-肌動蛋白，Bcl-2為B細胞淋巴瘤-2。①與NG組比較，P<0.05。②與NC組比較，P<0.05。③與PVT1-inhibitor組比較，P<0.05。

組別NG組NC組PVT1-inhibitor組PVT1-inhibitor+miR-214-3p-inhibitor組F值P值重復次數6 6 6 6 Ki-67/β-actin 1.18±0.18 1.20±0.19 0.57±0.09①②0.85±0.13①②③23.08<0.001 Bax/β-actin 0.33±0.04 0.35±0.05 0.97±0.16①②0.67±0.11①②③52.75<0.001 Bcl-2/β-actin 0.95±0.14 0.96±0.15 0.30±0.05①②0.71±0.11①②③40.44<0.001

圖1 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較

2.6雙熒光素酶報告基因檢測miR-214-3p對PVT1的轉錄調控Targetscan（http：//www.tar‐getscan.org/）預測結果顯示，PVT1與miR-214-3p基因序列存在結合位點，見圖2。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，轉染PVT1 WT的實驗中，miR-214-3pinhibitor-PVT1-WT組熒光素酶活性（1.37±0.21）顯著高 于miR-214-3p-inhibitor-NC-PVT1-WT組（1.03±0.15）（t=3.23，P=0.009）。

圖2 miR-214-3p與變異性漿細胞瘤異位1（PVT1）基因靶向關系

NG組（0.38±0.06）、NC（0.35±0.05）、PVT1-inhib‐itor組（1.15±0.17）及PVT1-inhibitor+miR-214-3p-in‐hibitor組（0.80±0.12）PVT1蛋白表達比較，F=70.25，P<0.001；與NG組、NC比較，PVT1-inhibitor組顯著升高（P<0.05）；與PVT1-inhibitor組比較，PVT1-in‐hibitor+miR-214-3p-inhibitor組顯著降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組人皮膚黑色素瘤SK-MEL-1/DDP細胞XIAP蛋白表達比較

3 討論

CMM是具有較強侵襲及轉移能力的皮膚惡性腫瘤之一，發病率及病死率高［11］。目前CMM病人主要以化療作為術后輔助治療手段，DDP是臨床常用一線化療藥，其半衰期短，需持續給藥以維持藥物有效濃度，使得腫瘤細胞易產生原發或繼發耐藥性，以致化療效果極不理想［12］。因此研究CMM生物治療靶標增強DDP耐藥細胞敏感性，已成為臨床研究熱點。

lncRNA為一種非編碼RNA，在基因水平調控、細胞分化和發展等過程中發揮重要作用，其表達異常可導致癌癥發生［13］。Chen等［14］研究顯示，抑制PVT1表達可顯著抑制黑色素瘤細胞增殖、侵襲及轉移等，可能成為黑色素瘤潛在治療靶點。Wang等［15］研究顯示，PVT1在耐DDP的口腔鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達上調，增加癌細胞順鉑耐藥性。目前認為化療是通過多種途徑介導腫瘤細胞凋亡來殺死癌細胞［16］。ki-67蛋白是細胞增殖相關基因蛋白，在癌變組織中呈高表達，Bcl-2是一種原癌基因，能抑制細胞凋亡，Bax是人體主要的促凋亡基因［17］。本研究以SK-MEL-1/DDP細胞為研究對象，成功轉染后，結果顯示，與NG組、NC組比較，PVT1-inhibi‐tor組SK-MEL-1/DDP細胞PVT1水平、Ki-67、Bcl-2蛋白表達均顯著降低，細胞增殖抑制率、凋亡率、miR-214-3p及Bax表達均顯著升高。說明抑制PVT1表達可能通過上調miR-214-3p表達抑制SKMEL-1/DDP細胞增殖并誘導細胞凋亡。與NG組、NC組比較，PVT1-inhibitor組SK-MEL-1/DDP細胞IC50顯著降低。與既往腫瘤相關研究［18］中表達模式一致，提示抑制PVT1表達可能提高SK-MEL-1/DDP細胞對DDP的化療敏感性。miR-214-3p是長度為20-23個核苷酸的單鏈RNA分子，是基因表達的重要調節劑，能夠介導腫瘤發生［19］。Chen等［20］研究顯示，過表達PVT1可靶向下調miR-214表達促進卵巢癌細胞增殖及轉移。XIAP是凋亡抑制基因家族成員之一，能夠拮抗多種凋亡誘導因素，抑制細胞凋亡［21］。蔡松濤等［22］研究顯示，過表達微小RNA-23b-3p可靶向下調XIAP表達抑制類風濕關節炎滑膜成纖維細胞增殖并促進其凋亡。Yang等［23］研究顯示，過表達miR-214-3p可靶向下調XIAP表達促進視網膜母細胞瘤細胞凋亡以降低細胞對多種化學藥物敏感性。本研究預測到PVT1與miR-214-3p存在結合位點，且進一步證實，miR-214-3p-inhibitor-PVT1-WT組熒光素酶活性顯著高于miR-214-3p-inhibitor-NC-PVT1-WT組，與NG組、NC組比較，PVT1-inhibi‐tor組SK-MEL-1/DDP細胞miR-214-3p水平顯著升高、XIAP mRNA及其蛋白表達顯著降低；當轉染miR-214-3p-inhibitor后，發現下調PVT1表達抑制SK-MEL-1/DDP細胞增殖并促進細胞凋亡能力顯著降低，細胞IC50明顯回升，且miR-214-3p水平顯著降低、XIAPmRNA和蛋白表達顯著升高。說明下調PVT1表達提高SK-MEL-1/DDP細胞對DDP的化療敏感性，可能是通過靶向上調miR-214-3p，抑制XIAP表達實現的。

綜上所述，過表達PVT1可能通過靶向下調miR-214-3p表達，進而上調XIAP表達降低SK-MEL-1/DDP細胞對DDP的化療敏感性。CMM發生及耐藥機制復雜，關于PVT1與miR-214-3p/XIAP軸在SK-MEL-1/DDP細胞化療耐藥中的具體作用機制仍需深入探索。