磷脂酶D特性及其在磷脂酰絲氨酸合成中的應用

郭碧珊，張夢雪，王鋆坦，杜 瑞，朱海華,2, ，許 君，王法云,2，王 慧,4

（1.河南省商業科學研究所有限責任公司，河南鄭州 450002；2.河南省食品質量安全控制工程技術研究中心，河南鄭州 450002；3.河南農業大學生命科學學院，河南鄭州 450002；4.上海交通大學醫學院公共衛生學院，上海 200025）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）作為構成機體神經組織細胞的基本磷脂類物質，是腦細胞信息讀取，傳遞和記憶的重要介質[1]，被譽為“大腦維生素[2]”。PS具有預防老年癡呆[3]，改善大腦記憶，緩解抑郁癥，提高兒童注意力[4]等功效。因此，PS被列為新資源食品和功能性食品，在保健食品、化妝品以及制藥工業中得到廣泛應用[5]。PS的制備方法主要有化學合成法、溶劑萃取法和酶法合成。其中化學合成法和溶劑萃取法因工藝復雜、環境不友好、產率低、純化困難等不適用于大規模工業化生產，而酶法合成因反應條件溫和、環境友好、PS產量大、成本低等優點而備受關注[6-8]。磷脂酶D（Phospholipase D，PLD，EC 3.1.4.4）是酶法合成PS的關鍵酶，其屬于磷酸二酯酶超家族成員[9]，不僅可以將磷脂酰膽堿水解生成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA），也可通過轉磷脂?；铣蒔S等稀有磷脂[10-11]。PLD在植物、動物和微生物中無處不在，其中微生物PLD由于較高的催化性能和簡單的純化過程成為目前PS生產中使用最廣泛的酶[6,12-13]。

近年來微生物PLD的研究主要集中在反應體系優化以及酶的重復使用上。黃琳等[14]通過重組表達獲得PLD，優化單水相中PS生成條件，使其產率達33%；Liu等[15]通過將PLD表面展示到畢赤酵母表面實現酶的重復利用，繼而優化純水體系中PS的生成條件，最終轉化率達53%； Zhang等[16]將PLD固定化到-C18修飾的有序中孔二氧化硅立方體（OMSC）中，優化兩相體系中PS的生成條件，轉化率高達91.2%。大量文獻表明，無論PLD酶以何種形式發揮作用，反應體系的不同對PS產率有很大影響。因此，對PLD催化制備PS的反應體系進行研究很有必要。

本文對微生物PLD的特性及其在制備磷脂酰絲氨酸方面的應用進展進行了綜述，并重點介紹了不同的反應體系下PLD催化生產PS的差異，為PS的綠色高效生產提供理論指導，從而加快PS在功能食品中的開發和應用，促進我國大健康產業的發展。

1 微生物PLD的特性

1.1 PLD的分子結構特點

PLD作為磷脂酶超家族成員，具有該家族的明顯特征：高度一致的保守序列HxKxxxxD，該保守序列是催化水解的活性部位。Hough[17]在2000年首次解析出了鏈霉菌PMF-PLD的三維結構（圖1）。該酶分子結構呈雙葉型，兩個HKD保守序列沿著對稱軸彼此相鄰。兩個結構域單體由三十五個二級結構組成，呈α-β-α-β-α狀排列，每個β鏈包括8～9個β折疊，兩側含有18個α螺旋。在二聚體界面上存在一個30 ?孔徑的活性位點以方便底物進入，兩個柔性環延伸到活性位點的入口上方，從而可以調節界面脂質的相互作用。

圖 1 鏈霉菌PMF-PLD的三維蛋白結構Fig.1 Tertiary structures of PMF-PLD

1.2 PLD的催化機理

PLD是具有特殊性質的酯鍵水解酶，具備水解磷酸二酯鍵和堿基互換的能力。一方面它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有機堿（如膽堿、乙醇胺等）羥基成酯的鍵，釋放原來磷脂的極性頭部，生成磷脂酸和羥基化合物膽堿；另一方面，除水解作用外還能催化一些含羥基的化合物與磷脂的堿基進行堿基交換反應，生成新的磷脂。利用此特性可對磷脂進行改性，以富含磷脂酰膽堿的磷脂為底物，進行磷脂酰基轉移反應，可為大量制備稀有磷脂和純化單體磷脂提供有效的途徑（圖2）[18]。

圖 2 磷脂酶D的催化反應Fig.2 Phospholipase D-catalyzed reaction

1.3 PLD的底物特異性

PLD酶因其來源及結構不同，其底物特異性也不同，可作用于含有不同頭部基團的磷脂。且在轉酯反應中，受體醇與水分子互為競爭關系，因此，不同來源PLD的轉酯能力取決于兩個HKD模塊的化學和空間環境。與動植物來源的PLD相比，微生物來源的PLD有更強的轉酰能力以及更為廣泛的底物選擇譜，其中，鏈霉菌來源的PLD與其它來源PLD相比，由于呈現出最緊密的結構，且轉酯與水解能力之比相對較高，而被廣泛研究[19]。

即使酶來源相同，同種PLD酶的底物特異性也不同，其水解和轉酯活力受底物多種因素影響：磷脂?；溄M成、頭部醇的結構尺寸以及底物聚合形態。通常脂肪酸中含有6～8個碳原子的?；湵雀L鏈具有更快的催化速率，對卷心菜和罌粟重組PLD同工酶的研究表明，氨基酸的少量變化也可導致水解和轉酯活性的顯著變化[20]。Dippe等[21]通過定點飽和酪氨酸殘基突變研究發現，頭部醇尺寸越小越有利于酶與底物結合并發揮作用。Dawson等[22]對菠蘿PLD催化多種聚合形態底物進行研究，發現底物以小聚合狀態存在時，PLD催化能力較強。

1.4 影響PLD活力的因素

影響PLD活力的因素有很多，包括溫度、pH、鹽類、溶劑以及反應體系等[23]。PLD最適溫度和pH受其來源影響較大：大多數PLD的最適催化溫度為25～45 °C，部分在55～60 °C時活力最高[24]；來源于植物的PLD最適pH在5～6之間，微生物來源的范圍較寬，在4～8之間。鹽對酶活性的影響也較顯著。研究表明，對PLD催化反應影響最顯著的為鈣離子[25]，鈣離子不僅能激發PLD的催化活力，而且能提高其熱穩定性；TritionX-100等具有乳化作用的鹽也能提高PLD的活性[26]；除此之外，還有Mg2+、Mn2+、Fe2+等均影響PLD酶活，酶來源不同，離子對其活性作用不同。不同體系中PLD表現的活力也不同，PLD對水溶性底物的作用比較緩慢，而在油-水界面上作用較好。因此，增加油-水界面條件和有利于酶吸附在界面的因素，可提高酶活力，增加催化反應速率。

2 微生物PLD催化制備磷脂酰絲氨酸研究

PS是從牛腦中發現并被定性的[27]。在PS的結構組成中，帶有負電荷的頭部為親水性，而由脂肪酸組成的尾部為親脂性[28]。不同來源的PS其脂酰殘基差別較大，因此PS是混合物，不是單一成分。而該性質也決定了PS制備方法的多樣性，主要包括化學合成法、溶劑提取法和PLD酶轉化法。

化學合成法和溶劑提取法屬于非酶催化法。化學合成工藝復雜，成本較高，且合成結束會出現有機溶劑濃縮回收以及合成產品中溶劑殘留問題，易使PS受到污染；溶劑提取法有機溶劑消耗量大，獲得的PS純度低，且由于“瘋牛病”的流行，其安全性受到質疑，已經逐漸被淘汰[29]。因此，這兩種方法均不符合我國大健康產業的發展和國民綠色健康的理念。而PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸既環保又安全，已經成為生產PS的理想方法[30]。

2.1 PLD酶催化法制備磷脂酰絲氨酸

酶催化法是指底物PC和L-絲氨酸在PLD的作用下生成PS。酶催化法具有反應條件溫和、反應易控、高效簡單等優勢，逐漸得到廣泛的研究及應用。由于底物PC和產物PS易溶于有機相，而PLD和L-絲氨酸易溶于水相，造就了PS制備體系的多樣性，這些體系主要包括單相反應體系、兩相反應體系和新型環保溶劑反應體系。因此，該研究進展對PS生產的反應體系進行了總結。

2.1.1 單相反應體系

2.1.1.1 傳統單相反應體系 傳統單相反應體系即反應只在水相中進行，全程沒有有機溶劑的使用。由于卵磷脂的雙親性，反應液多為均質膠或懸濁液狀態。一般是先將底物卵磷脂利用均質設備打散，然后在絲氨酸和酶的作用下共同反應。黃琳等[14]利用重組PLD在單水相體系中催化大豆卵磷脂進行轉酯酰反應，6 h后PS產率可達33%；黃婷婷[31]優化純水相中生產PS工藝，以PC60為底物，反應6 h后，PS轉化率可達到96.7%，副產物PA僅生成0.2%，實現了底物向產物高效轉化。但不可否認，單水相中水的存在會導致PLD的水解活性增強，因此需要進一步優化條件以降低PC的水解率及提高PS的生成率。

一方面是調整PC與水的比例和絲氨酸的濃度等條件，一方面是利用硫酸鈣和硅膠作為吸附載體吸附底物PC進行酶轉化。Zhang等[32]研究了兩種PC吸附模型：TritonX-100與二氧化硅共價結合模型和二氧化硅吸附PC模型。兩種模型被成功用于純水相中PLD介導的轉磷脂酰反應，PC裝載量達到98.9%，PS收益率達到99.0%，為PS的連續生物合成提供了一種很有前景的方法。

2.1.1.2 固定化酶單相反應體系 到目前為止，固定化PLD已在多種有機溶劑（如乙醚、氯仿、甲苯）中進行轉磷脂?；磻?，以達到PS的最大產率[33]。但是有機溶劑具有易燃性、揮發性和毒性，使其生產的PS難以應用在功能食品和醫藥制品中，因此提高單水相中轉酯反應的效率勢在必行。Mao等[34]將PLD固定在環氧基載體上，在純水溶液中采用固定化PLD合成PS，轉化率65%，整個過程避免了有機溶劑的影響，由于其具有安全性，且產品回收過程簡單，因此在PS的工業生產中具有廣闊的前景。

2.1.2 兩相反應體系

2.1.2.1 傳統兩相反應體系 傳統的兩相反應體系為水-有機溶劑體系。在兩相體系中，轉酯反應和水解反應同時進行，且水解反應會影響目的產物PS的生成。一方面有機溶劑會與水化層發生作用，影響酶的活力，另一方面水的存在會導致水解副產物PA大量生成，降低PS生成率。因此，Chen等[6]首次利用含水量為6.25%（V/V）的微水相-有機溶劑兩相體系，通過減少水的存在來抑制水解反應；馮小娜等[35]則是利用蛋白質工程改造策略擴大底物PC催化通道，降低位阻效應，同時提高活性位點與絲氨酸的親和力，降低水解反應的同時提高了PS生成率。

兩相反應體系的酶轉化研究集中在有機相種類選擇、兩相體積比、PC與絲氨酸質量比、反應溫度、pH等方面。表1總結了目前一些具有代表性的研究結果。

2.1.2.2 固定化酶兩相反應體系 Wu等[40]制備了一種新型的固定化PLD的環氧樹脂基納米復合材料。固定化酶在正庚烷為有機相，磷酸鹽緩沖液為水相的反應體系中，實現了底物PC的高轉化，轉化率達96.2%；Liu等[7]利用基因工程和分子生物技術將PLD成功展示在畢赤酵母表面，在乙醚為有機相，乙酸鈉緩沖液為水相的反應體系中，PC轉化率為67.5%。固定化酶可增強PLD的穩定性和可重復使用性，表面展示系統還避免了酶的分離純化，具有極大的工業化生產潛力。

二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）是長鏈多不飽和脂肪酸，主要存在于海洋微生物、動物和浮游植物體內，具有極好的營養保健功能。Zhou等[41]從鯡魚卵中提取富含DHA的磷脂酰膽堿（DHA-PC），合成DHA-PS；于剛等[42]以魷魚卵磷脂為原料，利用PLD酶法合成富含EPA和DHA的PS。然而酶法合成用到的有機溶劑具有一定的毒性，濃縮回收過程中加熱時間過長也會導致熱敏性PS的過氧化值過高。因此兩相反應體系生產的PS不適合添加到食品、醫藥中，所以生物安全型、環境友好型試劑被逐漸研發用于PS的合成。

2.1.3 綠色環保溶劑反應體系 水單相反應體系會使反應向有利于水解反應的方向進行，造成副產物PA的大量生成；傳統兩相反應體系所用有機溶劑有毒，生成的PS不適合添加到食品、醫藥中。因此，各種綠色生物質溶劑應運而生。如γ-戊內酯[43-44]、脂肪酸甲酯[45]、檸檬烯[46]、離子液體[47]、深共晶溶劑[48-49]和2-甲基四氫呋喃[44]等，在實現對環境無污染無毒的同時，也保證了PLD催化的轉磷脂酰反應具有70%～95%的轉化率。因此隨著人們健康理念的深入，綠色生物質溶劑將具有極大的市場前景。

綜上，PLD酶催化法制備PS的反應體系可細分為五類，表2對這幾種反應體系的特點進行了總結?？傮w而言，目前對單水相和有機相/水相雙相系統的研究較多，其PS產率整體上可達到較高的水平。綠色生物質溶劑雖有其獨特的優勢，但是因為其屬于新型溶劑，目前對這類化合物的研究應用還不是很多，和傳統的有機溶劑相比究竟哪個具有更高的人體安全性尚無定論，因此未來仍要著重探索PLD酶在新型溶劑中的催化機理。

表2 不同反應體系的特點Table 2 Characteristics of different reaction systems

3 總結與展望

隨著我國大健康產業的發展以及“健康中國”、“綠色產業”的理念倡導，國民營養健康的需求會越來越多。磷脂酰絲氨酸作為一種新型食品資源，在改善老年人記憶力、治療抑郁癥和兒童多動癥等方面具有重要作用，因此高純度的PS在功能食品和保健食品中市場潛力巨大。本文主要對微生物PLD酶法制備PS的不同反應體系進行了綜述?？傮w而言，雖然在單相體系純水溶液中PS的生成率一般低于水-有機溶劑兩相體系中的生成率，但是要實現PS在功能食品和醫藥制品中的安全應用，在純水溶液中生產PS是大勢所趨，未來仍是研究方向的重點。建議一方面在PS生成過程中，選擇合適的載體，吸附底物PC或將PLD酶固定化，提高酶的利用率，實現PS的連續生物合成，降低PS生產成本。另一方面篩選出高轉磷脂活性酶的微生物，降低PLD的生產成本，并利用生物技術手段從分子層面出發，提高PLD的轉酯效率，并繼續驗證新型綠色環保溶劑的毒理學評價。相信在研究人員的共同努力下，PLD的相關研究能夠為加快PS在功能食品新產品中的開發和應用奠定基礎，為國民健康保駕護航。