響應(yīng)面法優(yōu)化香榧假種皮黃酮提取及活性研究

孫千雅，毛依依，孫熔茹，戴妙燁，周文潔，孫小紅*

紹興文理學(xué)院元培學(xué)院（紹興 312000）

香榧（Torreya grandis）為紅豆杉科榧樹屬常綠喬木，是人工選擇培育的優(yōu)良品種，有耐寒、喜光、好濕潤的特性[1]，主要集中我國南方濕潤區(qū)，諸如浙江諸暨、嵊州等地。香榧假種皮為香榧外層厚肉質(zhì)化部分，質(zhì)量占比可達(dá)鮮重的50%～60%，作為香榧加工后的殘余廢料，多因無高效處理方式而造成腐爛污染。研究發(fā)現(xiàn)香榧假種皮富含二萜類、揮發(fā)油、黃酮類等生物活性成分[2-3]，對其中的醇、醛、烯等20多種芳香成分適當(dāng)提取后，可用于高級精油的制作[4-6]。所提取的植物黃酮具有明顯的抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗癌等作用[7-8]，并在醫(yī)藥、食品和日用化工等領(lǐng)域有廣闊市場前景[9-10]。張露等[11]首次比較香榧各不同部位提取物成分的差異，其中黃酮成分在香榧假種皮和香榧莖中的含量最高。

植物黃酮常用提取方法有水提取法、醇提取法、微波提取法、超聲波輔助提取法及超臨界流體萃取法（SFE）。試驗(yàn)以乙醇為主要溶劑，采用超聲波輔助溶劑法提取香榧假種皮中的黃酮。設(shè)計相應(yīng)的單因素試驗(yàn)，應(yīng)用響應(yīng)面法綜合分析，對提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并測定香榧假種皮總黃酮的體外活性，從而為香榧假種皮黃酮的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧假種皮（2020年10月采自浙江嵊州香榧產(chǎn)區(qū)）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH、ABTS（上海麥克林生化科技有限公司）；α-葡萄糖苷酶（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；α-淀粉酶（邢臺萬達(dá)生物科技有限公司）；PNPG（南京都來生物有限公司）；其他試劑均為分析純AR。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；800Y高速多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；SK2200H超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；722N可見分光光度計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；JA2003電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法測定黃酮類化合物，將吸光度A設(shè)為縱坐標(biāo)，濃度C設(shè)為橫坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=9.75C-0.002 6（R2=0.999）。

1.3.2 總黃酮得率的測定

參照1.3.1中的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定香榧假種皮中總黃酮得率，按式（1）計算。

式中：C為1.3.1中得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為稱取的香榧假種皮粉末質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計

為初步了解各因素對黃酮得率的影響，分別選用超聲功率（160，240，320，400，480和560 W）、超聲時間（20，30，40，50，60和70 min）、液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1和70∶1 mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%，80%和90%）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.4 響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)BBD試驗(yàn)的設(shè)計原理，采用溫度60 ℃，超聲功率、超聲時間、液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，總黃酮得率為指標(biāo)，制定相關(guān)因素的發(fā)展水平表，可見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

1.3.5 體外抗氧化活性試驗(yàn)與體外降血糖試驗(yàn)

香榧假種皮中的總黃酮對DPPH、ABTS自由基的清除作用，分別參考胡衛(wèi)成等[13]的測定方法及秦晶晶等[14]的測定方法。對抑制α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶活性的測定，分別參考姚志仁等[15]和李勝華等[16]的測定方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1可知，總黃酮提取率于480 W時出現(xiàn)最高值，以480 W為分界，前段呈上升趨勢，后段呈下降趨勢，推測得率下降原因可能是超聲過度破壞黃酮結(jié)構(gòu)，因此選擇超聲功率480 W進(jìn)行黃酮提取試驗(yàn)。

圖1 超聲功率對總黃酮得率的影響

由圖2可知，總黃酮提取率于30 min時出現(xiàn)最大值，以30 min為分界，前段呈上升趨勢，后段呈下降趨勢。推測得率下降原因可能也是過度超聲破壞黃酮結(jié)構(gòu)，為保證黃酮提取率及減少提取時間，選擇超聲時間30 min進(jìn)行黃酮提取試驗(yàn)。

圖2 超聲時間對總黃酮得率的影響

由圖3可知，液料比60∶1（mL/g）時總黃酮得率出現(xiàn)最大值，但為減小過濾時間及減少溶劑浪費(fèi)，選擇液料比40∶1（mL/g）進(jìn)行黃酮提取試驗(yàn)。

圖3 液料比對總黃酮得率的影響

由圖4可知，總黃酮提取率于60%乙醇體積分?jǐn)?shù)出現(xiàn)最大值，以乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為分界，前段呈上升趨勢，后段呈下降趨勢。提取率下降原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時，極性減小，導(dǎo)致親脂性的部分成分溶解，黃酮類物質(zhì)競爭性結(jié)合乙醇-水分子[17]。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%進(jìn)行黃酮的提取試驗(yàn)。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

試驗(yàn)響應(yīng)面的設(shè)計與結(jié)果見表2，數(shù)據(jù)方差分析及顯著性檢驗(yàn)見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

將4個單因素與響應(yīng)值Y通過Design Expert v8.0軟件進(jìn)行回歸擬合，可得到總黃酮得率（Y）的多元二次回歸擬合方程：Y=-110.221 25+0.019 577A+0.770 60B+0.995 47C+3.046 45D+6.000 00×10-4AB-8.812 50×10-4AC-1.968 75×10-4AD-2.500 00×10-5BC-7.800 00×10-3BD+8.700 00×10-3CD+2.122 40×10-6A2-0.010 114B2-0.012 764C2-0.026 214D2

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

從表3可知，模型F值為3.14，p值=0.020 2（＜0.05），說明該模型水平差異顯著，失擬項p=0.100 5（＞0.05），說明該模型失擬項差異不顯著，具有較高擬合度。二次項（C）p=0.030 4＜0.05，有顯著影響，二次項（D）p=0.000 2＜0.01，有高度顯著影響；交互項對回歸模型影響不顯著。4個因素的作用強(qiáng)度由強(qiáng)至弱，依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞超聲功率＞超聲時間。

由于試驗(yàn)中各因素間存在兩兩相互作用以及最佳參數(shù)與各參數(shù)間的交互作用，可得到以響應(yīng)面圖形的響應(yīng)值為結(jié)果的曲面圖[18-20]。根據(jù)表3的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合發(fā)現(xiàn)4個因素對香榧假種皮總黃酮得率不僅是簡單的線性關(guān)系，而是兩兩因素交互作用產(chǎn)生的差異現(xiàn)象。

據(jù)圖5可知，BD、CD的等高線圖形均呈橢圓狀，說明其相互作用顯著。而BC的等高線圖形更趨于圓形，說明其相互作用并不顯著。B的響應(yīng)面較陡峭，C次之，A與D較平緩。由此可說明，乙醇體積分?jǐn)?shù)為影響總黃酮提取的最顯著因素，液料比為次顯著因素，超聲功率與超聲時間也均為影響因素。

圖5 響應(yīng)面和等高線圖

2.2.3 最優(yōu)工藝條件的確定及模型驗(yàn)證

通過Design Expert v8.0軟件對回歸方程進(jìn)行推算，理論最佳工藝條件為超聲功率409.74 W、超聲時間25.75 min、液料比45.88∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)59.86%。在此最優(yōu)條件下得總黃酮得率為15.30 mg/g。鑒于試驗(yàn)操作合理性，將工藝調(diào)整為超聲功率400 W、超聲時間25 min、液料比45∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%。為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化后的工藝參數(shù)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際總黃酮得率為14.51 mg/g，與預(yù)測結(jié)果相近，證實(shí)試驗(yàn)采用優(yōu)化所得提取工藝條件準(zhǔn)確。

2.3 總黃酮體外抗氧化試驗(yàn)分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

由圖6可知，在一定范圍內(nèi)，VC對DPPH自由基的清除能力始終處于較高水準(zhǔn)，而總黃酮和BHT清除DPPH自由基的能力隨著自身濃度增加而先增強(qiáng)后趨于平緩。3種物質(zhì)對清除DPPH自由基的綜合能力為VC＞BHT＞總黃酮。質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.125 mg/g時，香榧總黃酮最大清除率可達(dá)69.43%。

圖6 香榧假種皮總黃酮對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定

由圖7可知，在一定范圍內(nèi)，VC、BHT和總黃酮對ABTS自由基的清除能力均隨著濃度增加而遞增，在0.125～0.150 mg/g范圍內(nèi)，VC、總黃酮的清除能力慢慢趨向平緩。3種物質(zhì)對清除ABTS自由基的綜合能力為VC＞總黃酮＞BHT。質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.150 mg/g時，香榧總黃酮可達(dá)到最大清除率99.85%。

圖7 香榧假種皮總黃酮對ABTS自由基的清除作用

2.4 總黃酮體外降血糖試驗(yàn)分析

2.4.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性測定

由圖8可見，在一定范圍內(nèi)，阿卡波糖和總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制作用都隨著濃度增加而遞增，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率上升速度略快于總黃酮。試驗(yàn)可證明阿卡波糖和總黃酮均對α-葡萄糖苷酶具有較好抑制作用，其抑制活性具有明顯劑量依賴性。兩者對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為阿卡波糖＞總黃酮。質(zhì)量分?jǐn)?shù)200 mg/g時，香榧總黃酮可達(dá)最大抑制率38.20%。

圖8 黃酮對α-葡萄糖苷酶活性的抑制

2.4.2 抑制α-淀粉酶活性測定

由圖9可知，在一定范圍內(nèi)，阿卡波糖、總黃酮和蘆丁對α-淀粉酶的抑制活性都隨濃度增加而呈上升趨勢，其中總黃酮抑制率略高于蘆丁抑制率，但遠(yuǎn)低于阿卡波糖的抑制率。質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0 mg/g時，香榧總黃酮可達(dá)到最大抑制率28.07%。

圖9 黃酮對α-淀粉酶活性的抑制

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化香榧假種皮總黃酮提取工藝，得出最優(yōu)條件：超聲功率409.74 W、超聲時間25.75 min、液料比45.88∶1（mL/g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)59.86%，總黃酮得率最高為15.30 mg/g。根據(jù)體外抗氧化活性與降血糖試驗(yàn)得出結(jié)論：香榧假種皮總黃酮對DPPH、ABTS有較好清除能力，對抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性較好。