主成分分析法優化檸檬果酒發酵工藝

殷小雪，杜慧慧*，陳煥，秦洪文，江鴻翎，劉行

重慶三峽學院生物與食品工程學院（重慶 404120）

檸檬[Citrus limon（L.）Burm.f.]屬于蕓香科柑橘屬常綠小喬木，喜溫耐陰不耐寒[1]。根據聯合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）數據庫統計，2019年中國檸檬種植面積約16萬 hm2[2-3]。萬州區位于長江上游結合部，三峽庫區腹地，氣候冬暖夏涼，適合栽植檸檬。萬州作為中國重要的檸檬三大產區之一，已有60年的種植歷史，2020年種植面積達0.67萬 hm2以上[4]。檸檬中不僅富含多種維生素，還含有大量檸檬酸，其果汁中維生素C含量達76 mg/100 mL。檸檬具有殺菌、美容、穩定情緒、提神、化痰止咳、生津健胃、降低膽固醇、促進牙齒生長、防止牙齦出血、預防壞血病和心血管動脈硬化等功效[5-7]。

由于感官評定易受評價人員的主觀影響，導致感官結果誤差大，故采用模糊數學法與感官評價相結合，使感官指標數字化，保證結果的科學可靠[8-9]。另外，食品品質影響因素眾多，可通過主成分分析法（PCA）對主要因素進行分析，并建立數學模型，從而得到的產品綜合評價更加準確[10-11]。

試驗以三峽庫區尤力克檸檬為主要原料，應用模糊數學感官評價法從色澤、香氣、滋味和風格4個方面真實客觀評價檸檬發酵酒，對檸檬發酵酒模糊感官評分、酒精度、總糖含量、總酸含量等進行主成分分析，建立綜合評價模型，并結合正交試驗優化檸檬酒釀造工藝流程，為檸檬的深加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

尤力克檸檬（重慶市萬州區橫山村采摘）；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母（食用級，安琪酵母股份有限公司）；白砂糖（永輝超市購買）；玻璃層析柱（30 mm×500 mm，宸喬科技有限公司）。

1.2 試驗試劑

β-環狀糊精（食品級，浙江一諾生物科技有限公司）；大孔弱堿性陰離子交換樹脂（D318、D301G、D301、D315）、弱堿性環氧系陰離子交換樹脂（330，鄭州和成新材料科技有限公司）；DNS試劑（化學純）、鄰苯二甲基氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 儀器與設備

電子天平（瑞安市樂祺貿易有限公司）；pH-100型pH計（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；HT-512ATC型糖度計（上海丙?？萍加邢薰荆还茖Ｓ眯途凭嫞熍_帝伯仕自釀機有限公司）；精密膜過濾器（煙臺帝伯仕自釀機有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；SP-756型可見光分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程

檸檬鮮果→去皮、瓤、籽→滅菌→裝罐→配料、接種→主發酵→后發酵→陳釀→澄清→過濾→裝瓶

1.4.2 操作要點

選擇完全成熟、無蟲害、無霉爛的檸檬鮮果，40℃流水沖洗，將附著在檸檬上的土壤、微生物以及殘留的農藥清洗干凈。剝去果皮、果瓤和籽，得到檸檬果肉。調整糖度，按一定的料液比裝罐，裝至發酵罐容積的80%。接入活化后的酵母溶液，攪拌充分。在25 ℃密閉環境下發酵。待發酵醪液面上升，表示主發酵開始，每日測定發酵罐中的各項理化指標。直至可溶性固形物及pH無變化時，主發酵結束[12]。經后發酵[13]，根據NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》放置于干凈通風的貯酒室進行陳釀。隨后添加澄清劑使檸檬果酒中的雜質沉淀，液體澄清；采用精密膜過濾器，去除細小雜質[14]。

1.4.3 理化指標測定

pH，參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH的測定》；可溶性固形物，按手持糖度計法測定；總糖含量，按DNS試劑法測定；總酸含量，按酸堿滴定法測定；酒精度，按酒精計法測定，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.4 模糊數學感官評價

設檸檬果酒的評價因素集合為U=（u1，u2，u3，u4），u1、u2、u3和u4分別代表檸檬果酒的色澤、香氣、滋味和風格。建立評價評語集合。設檸檬果酒的評價評語集合為V=（v1，v2，v3，v4）=（90，80，70，60），v1、v2、v3和v4分別代表優、良、中和差4個等級，每個等級分別對應90，80，70和60分。通過采用強制決定法[15]確定檸檬果酒的權重集合W=（w1，w2，w3，w4）=（0.3，0.2，0.4，0.1），即色澤、香氣、滋味和風格分別占比0.3，0.2，0.4和0.1。由10名評價人員按表1標準對檸檬果酒進行感官評價，假設檸檬果酒得分情況如表2所示。

表1 檸檬果酒感官評價標準

表2 檸檬果酒感官評價得分情況匯總表

1.4.5 矩陣變換及模糊感官綜合評價

通過將表中數據進行轉化即可得到檸檬果酒的模糊感官評價得分矩陣R。

令模糊感官的綜合評分集合為Y，根據模糊變換原理Y=W×R，即矩陣變化如式（2）所示。

檸檬果酒的模糊感官評分為綜合評分集合Y與評語集合V的乘積，即模糊感官評分T=Y×V[16]。

1.4.6 單因素試驗

將檸檬果酒的基本條件設置為主發酵溫度25 ℃、糖度25%、酵母添加量0.12%、料液比1∶0 g/mL、發酵時間15 d。按照上述試驗流程及操作要點進行單因素試驗，分別研究糖度（17%，18%，19%，20%和21%）、酵母添加量（0.08%，0.10%，0.12%，0.14%和0.16%）、料液比（1∶0，1∶0.1，1∶0.2，1∶0.3和1∶0.4 g/mL）和發酵時間（11，13，15，17和19 d）對檸檬果酒模糊感官評分的影響。

1.4.7 正交試驗

采取小組評分法，確定10名評定人員進行模糊感官評定。以檸檬果酒的模糊感官評分作為評判標準，分析檸檬果酒的單因素試驗結果，制定各因素正交試驗水平（表3）。

表3 正交試驗因素水平表

1.5 超高效液相色譜測定類黃酮含量分析

1.5.1 樣品預處理

檸檬果酒充分搖勻，吸取1 mL提取液，過0.22 μm親水性PTFE膜到2 mL進樣小瓶，待測。

1.5.2 儀器條件

UPLC檢測主要參考趙梓燕[17]的方法。具體方法：使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國），以0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）作為流動相，梯度洗脫，分離條件為0～0.6 min，10%～20% B；0.6～5.0 min，20%～70% B；5.0～7.0 min，70%～90% A；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積1 μL；檢測波長283 nm（黃烷酮）和330 nm（PMFs）。

1.6 數據分析

使用軟件SPSS 20.0進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

糖度對檸檬酒模糊感官評分的影響如圖1（A）所示。糖度20%時，其模糊感官評分值最高，其色澤、香氣、滋味、風格都達到最佳。

酵母添加量對檸檬酒模糊感官評分的影響如圖1（B）所示。酵母添加量0.14%時，其模糊感官評價分達到最高值。

檸檬果酒的模糊感官評分隨著料液比變大呈現先增加后減小趨勢，料液比1∶0.2 g/mL時，檸檬果酒模糊感官評分達到最大（圖1C）。料液比的增加會使檸檬果酒的透明度、色澤逐漸變好。

當發酵時間小于15 d時，檸檬酒渾濁、無光，無明顯的酒香，滋味偏酸澀，酒體風格不協調。當發酵時間大于15 d，檸檬酒色澤偏淡，滋味由于檸檬過度發酵而導致苦澀，檸檬果酒的模糊感官評分下降。由圖1（D）可知，最適發酵時間為15 d。

圖1 檸檬酒發酵中單因素結果

2.2 正交試驗結果

由表4可知，5號試驗產品的模糊感官評分最高，對應的試驗組為A2B2C3D1，極差的結果顯示RB＞RA＞RD＞RC，表明酵母添加量對產品的影響最大，糖度和發酵時間的影響程度次之，料液比對檸檬果酒的模糊感官評價影響最小。通過k值的大小可得到其最優比為A2B2C2D1。

表4 正交試驗樣品模糊感官評分

2.3 正交試驗樣品PCA綜合得分正交結果分析

由表5可知，極差分析結果顯示RB＞RA＞RD＞RC，結果表明各因素對檸檬果酒的PCA分析綜合得分的影響程度為酵母添加量＞糖度＞發酵時間＞料液比。檸檬果酒的最優配方為A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發酵時間13 d。正交試驗的最優配方在正交試驗組中，其PCA綜合得分為0.94。對正交試驗結果進行方差分析（表6）得到糖度、酵母添加量、料液比對檸檬果酒的PCA綜合得分的影響極顯著（p＜0.05）。表7顯示不同發酵組的總酸、總糖和酒精度存在差異。

表5 PCA正交試驗綜合得分

表6 方差分析表

表7 檸檬酒感官指標和理化指標結果

2.4 試驗驗證結果分析

根據正交試驗中k值的大小得到檸檬果酒的最優比為A2B2C2D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.2 g/mL、發酵時間13 d，通過主成分分析正交試驗樣品得到的檸檬果酒的綜合得分最佳比為A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發酵時間13 d，由于2組試驗的基本條件不同，進行驗證性試驗每組做平行試驗3次。經過感官評定，A2B2C3D1果酒色澤呈橙黃色、澄清透明，有明顯的檸檬清香和酒香，香氣協調怡人，酸甜適口、醇厚純凈、無異味，酒體協調，典型極佳風格良好，模糊數學感官評分82.63±0.09分，酒精度11.8%±0.2%vol；A2B2C2D1果酒色澤呈橙黃色、澄清透明，檸檬清香和酒香協調性一般，口感醇厚純凈，酒體協調，風格良好，模糊數學感官評分80.12±0.12分，酒精度9.5%±0.1%vol。經過驗證性試驗A2B2C3D1組從感官以及酒精度都優于A2B2C2D1組。

2.5 有效成分含量測定

將最優工藝發酵的檸檬果酒置于10 ℃條件下陳釀120 d，使用超高效液相色譜法測定發酵檸檬果酒中含有圣草次苷455.685 mg/L、蕓香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奧司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L。

3 結論

由主成分綜合評價模型和正交試驗獲得最優配方為糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發酵時間13 d，其感官和酒精度較好，顏色呈橙黃色，澄清透明，具有檸檬清香和酒香，酒精度為11.8%±0.2%vol，且含有圣草次苷455.685 mg/L、蕓香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奧司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L，具有較好的食用及保健價值。