淡水魚中的孔雀石綠和隱性孔雀石綠的快速提取和檢測

謝湘武，劉柳*，韋媛媛，粟暉，傳杰杰

1.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西科技大學（柳州 545006）；2.廣西壯族自治區計量檢測研究院（南寧 530007）

孔雀石綠（malachite green，MG；分子式C23H25ClN2），屬于三苯基甲烷型的染料，進入人體或動物機體后，很快代謝成毒性更強、更穩定的隱性孔雀石綠（leuco malachite green，LMG；分子式C23H26N2），已被禁止作為抗菌劑、殺蟲劑、消毒劑[1]使用在水產養殖業和海產品的運輸途中。但由于孔雀石綠抗菌驅蟲能力極強，優于抗生素類藥品，許多水產業養殖業仍在違規使用，屢禁不止[2-3]。

水產品中LMG、MG的提取方法主要分2步。第一步是溶劑提取。在GB/T 20361—2006《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量測定的高效液相色譜熒光檢測法》[4]和GB/T 19857—2005《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》[5]中，均采用乙腈-乙酸銨緩沖液提取殘留物，加入二氯甲烷進行液液萃取。有學者[6]采用乙酸乙酯-正己烷-水對魚肉中的孔雀石綠進行提取，采用側流層析免疫分析法進行檢測，MG最低檢出限為1 ng/g。此外，丙酮-環己烷、乙酸乙酯-石油醚、乙腈-二氯甲烷提取體系常用于生物活性物質的提取，但在試驗中發現：丙酮-環己烷提取體系易使干擾物質大量富集在提取液難以除去；乙酸乙酯-石油醚體系提取時乳化現象嚴重，且回收率低；用乙腈-二氯甲烷提取效果最為理想，對分析結果無干擾影響。因此，乙腈對細胞組織具有良好滲透作用和沉淀蛋白的作用，是LMG和MG的最佳提取溶劑[7]。第二步是凈化濃縮，現行國家標準和文獻大多采用中性或酸性氧化鋁固相萃取柱對提取液進行固相萃取凈化[8]，除去油脂和其他雜質，再用N2吹干或旋轉蒸發濃縮[9-10]。此外，分子印跡聚合物（MIPs）和磁性分子印跡聚合物（MMIPs）[11]被廣泛用于對魚肉中MG和LMG的選擇性分離和富集，其中MMIPs不僅具有傳統MIPs高親和力的特點，還可以通過磁鐵快速輕松地分離，減少樣品前處理的時間。在文獻中尚未查詢到采用酸性氧化鋁粉末對魚肉樣品進行分散凈化的方法。

試驗在GB/T 19857—2005和相關文獻的基礎上，簡化了樣品前處理方法，減少了固相萃取的時間并提高樣品加標回收率；改進使用硼氫化鉀粉末將孔雀石綠完全轉化為隱性孔雀石綠[12-17]，有利于準確定量，減少誤差和氫氣產生，實現隱性孔雀石綠總量的測定。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（LC-20AT，日本島津公司）；渦旋混合器（XW-80A，上海精科實業有限公司）；低速臺式大容量離心機（TDL-5，上海隆拓儀器設備有限公司）；電子分析天平（AL104，上海梅特勒-托利多公司）。

隱性孔雀石綠（99%），孔雀石綠（99%）；乙腈（色譜級）；中性氧化鋁（200～300目，即0.085～0.075 mm）；硼氫化鉀（AR）；酸性氧化鋁（200～300目，0.085～0.075 mm）；乙酸銨（AR）；冰醋酸（AR）；淡水魚（市售）。

1.2 色譜條件

乙腈-乙酸銨緩沖溶液（pH 4.6）=75∶25（V/V）；Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；LMG檢測波長260 nm，MG檢測波長610 nm，進樣量20 μg/mL，流速1 mL/min。

1.3 不同提取方法的比較

在5 g不含MG和LMG的陰性樣品中分別添加1 mL 0.5 μg/mL的孔雀石綠和隱性孔雀石綠標準溶液，基于GB/T 19857—2005的提取方法，進行步驟刪減，考察不同提取方法的提取率。

1.3.1 國標法提取

完全按照GB/T 19857—2005方法進行提取。取5.0 g魚肉，添加穩定劑（1 mL鹽酸羥胺溶液、2 mL對-甲苯磺酸溶液、2 mL乙酸銨緩沖液），加入40 mL乙腈均質、離心，將上清液轉移至250 mL分液漏斗中，加入20 mL乙腈清洗殘渣，合并上清液。在分液漏斗中加入50 mL二氯甲烷分2次萃取，取下層二氯甲烷層，旋蒸濃縮近干。凈化：用6 mL乙腈分3次洗滌溶解，過0.075～0.085 mm（即200～300目）中性氧化鋁層析柱和陽離子交換柱，用2 mL乙腈洗脫，棄去中性氧化鋁柱，繼續用3 mL 2%甲酸、3 mL乙腈淋洗陽離子交換柱，棄去流出液。用4 mL 5%（V/V）乙酸銨甲醇溶液洗脫陽離子交換柱、用水定容至10 mL，濾液過0.45 μm濾膜過濾。

1.3.2 不添加穩定劑的國標法提取

在GB/T 19857—2005方法的提取步驟中不添加穩定劑（1 mL鹽酸羥胺溶液、2 mL對-甲苯磺酸溶液、2 mL乙酸銨緩沖液），其余提取方法步驟均不變，濾液進高效液相色譜分析測定。

1.3.3 無萃取步驟的國標法提取

在GB/T 19857—2005方法的提取步驟中無萃取步驟（不加入二氯甲烷進行液液萃取），其余提取方法步驟均不變，濾液進高效液相色譜分析測定。

1.3.4 快速提取方法提取

去掉魚鱗、魚皮和魚骨頭，取5 g可食部分魚肉，加入15 mL乙腈，在10 000 r/min勻漿機中勻漿30 s，加5 g酸性氧化鋁（200～300目，即0.085～0.075 mm）進行分散凈化，用渦旋混勻器振蕩30 s后，在4 000 r/min高速離心機離心5 min，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，得到待測樣本，進行高效液相色譜分析。

1.3.5 提取方法重復性試驗

制備含有LMG和MG加標樣品，分別進行快提法和國標法提取，重復5次試驗，測定LMG和MG殘留量，計算回收率和相對標準偏差。

1.4 標準工作曲線的繪制

準確稱取0.010 0 g孔雀石綠和隱性孔雀石綠標準品，用乙腈分別溶解定容至2個100 mL棕色容量瓶中，得到100 μg/mL的標準儲備液，各取1 mL儲備液稀釋成2 μg/mL的母液，依次稀釋成0.025～0.750 μg/mL的孔雀石綠和0.01～0.750 μg/mL的隱性孔雀石綠的系列標準溶液，繪制標準工作曲線。

1.5 方法學檢驗

測定市售水產品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的含量，在市售水產品中添加一定量的孔雀石綠和隱性孔雀石綠標準品，進行精密度、準確度、檢出限試驗。

1.6 孔雀石綠被還原為隱性孔雀石的轉化當量計算

在5 g陰性樣品中，添加一定量孔雀石綠、硼氫化鉀粉末，通過反應前后孔雀石綠的變化量及隱性孔雀石綠的生成量，計算轉化當量。

2 結果與討論

2.1 不同樣品前處理方法的提取率結果

在5 g陰性魚肉樣品中分別添加0.50 μg的MG和LMG，制備4份同時含有100 μg/kg LMG和100 μg/kg MG的加標樣品，分別按照4種提取方法進行提取，測定LMG和MG的含量。提取率結果如圖1和表1所示，快速提取法的提取率最高，LMG為99.1%，MG為77.1%，均高于其余3種提取方法。其中：國標法使用乙腈-二氯甲烷進行液液萃取，在振蕩后有部分樣品發生乳化，分層過程等待時間長且乳化層含水量高，不利于后續試驗；不加穩定劑的國標法，提取液清亮，易于過0.45 μm濾膜，但提取率不高；無萃取步驟的國標法，提取液渾濁，旋蒸后復溶、固相萃取，洗脫液過0.45 μm濾膜困難，測定提取率為0.0%；快速提取法經乙腈提取、酸性氧化鋁分散凈化，得到的提取液清亮，離心后易于過0.45 μm濾膜，提取率高于國標法。

圖1 不同提取方法的加標回收率

以快速提取法和國標法平行5次重復性試驗，結果如表1所示。快速提取法的相對標準偏差小于2%，優于國標法，重復性好，且MG和LMG的回收率高于國標法。

表1 重復性試驗結果

2.2 孔雀石綠和隱性孔雀石綠的標準工作曲線

以色譜峰面積對濃度作圖，孔雀石綠和隱性孔雀石綠的標準工作曲線、線性相關系數如表2所示。

表2 標準工作曲線

2.3 市售水產品的測定及加標回收率

將市售淡水魚放在一個水箱中，殺魚并按照乙腈快速提取法提取，提取液分成2份，一份直接測定，另一份加入一定量的MG和LMG標準混合溶液，測定樣品含量和樣品加標含量，計算樣品回收率，如表3所示，孔雀石綠回收率為92%～108%，隱性孔雀石綠回收率為96%～108%，分析方法準確可靠。淡水魚提取液的高效液相色譜圖，如圖2和圖3所示。

圖2 淡水魚中MG的高效液相色譜色譜圖

圖3 淡水魚中LMG的高效液相色譜色譜圖

表3 水產品中孔雀石綠和隱性孔雀石綠的加標回收率

2.4 檢出限試驗結果

取市售陰性草魚樣品，取5 g陰性魚肉樣品，準確加入一定量的MG和LMG，按快提法提取，測定提取液中MG和LMG直至信噪比S/N等于3時，對應檢出限如表4所示。MG的檢出限分別為0.005 μg/mL和20 μg/kg，LMG的檢出限分別為0.005 μg/mL和16 μg/kg。

表4 樣品檢出限的測定

2.5 孔雀石綠被還原為隱性孔雀石的轉化當量

在最優色譜條件下，取10 μg/mL孔雀石綠標準液，共6份，每份1 mL，準確加入0.3，0.9，1.2，5.1，10.1和15.1 mg硼氫化鉀粉末，離心，上清液過HLPC。孔雀石綠轉化結果如表5所示。0.3 mg硼氫化鉀即可將1 mL 10 μg/mL孔雀石綠百分之百還原為隱性孔雀石綠，即使加大硼氫化鉀粉末的用量，對于隱性孔雀石綠的含量幾乎沒有影響，6次測定結果的相對標準偏差為1.09%，1 μg孔雀石綠可以完全轉化為0.65 μg隱性孔雀石綠。

表5 孔雀石綠轉化為隱性孔雀石綠

硼氫化鉀極易溶于水而難溶于乙腈，在已有文獻[18-19]中，采用硼氫化鉀水溶液加入孔雀石綠中使其轉化為隱性孔雀石綠，試驗過程中發現，硼氫化鉀溶液在配制時不可避免地接觸空氣中的二氧化碳，二氧化碳遇水形成碳酸，而硼氫化鉀遇無機酸則分解放出氫氣，導致硼氫化鉀還原效率大幅降低，并且產生大量氣泡，離心管在高速離心時會發生炸裂，因此可使用硼氫化鉀粉末還原孔雀石綠后測定隱性孔雀石綠總量。

3 結論

以乙腈為溶劑快速提取淡水魚中的孔雀石綠和隱性孔雀石綠，無需加入鹽酸羥胺、對甲苯磺酸、乙酸銨等試劑，具有重復性好的特點；加入酸性氧化鋁粉末進行固相分散萃取，無需加入二氯甲烷液液萃取和進行固相萃取操作，能夠有效凈化樣品中的油脂和其他雜質，對孔雀石綠和隱性孔雀石綠的提取率和重復性優于國家標準，簡便快速；此外加入微量硼氫化鉀粉末能夠完全把孔雀石綠轉化為隱性孔雀石綠，實現隱性孔雀石綠總量的測定。此外，硼氫化鉀粉末在乙腈溶劑中不溶，避免使用硼氫化鉀水溶液易緩慢產生氫氣的缺點，適用于樣品高速離心，能夠滿足快速提取的要求。