雞蛋中維生素B1的含量檢測

武傳香，薛霞，盧蘭香，魏莉莉，丁一，劉艷明*

1.山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）；2.山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心（濟南 250101）；3.山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心（濟南 250101）

雞蛋作為生活中必不可缺的食品，因其具有較高的營養價值一直深受廣大消費者的喜愛[1-2]。目前市場上雞蛋種類繁多，如山雞蛋、草雞蛋、洋雞蛋，烏雞蛋，土雞蛋等，各類雞蛋的營養價值成為了評定其價格高低的重要指標[3-4]。2019年的3·15晚會指出，標稱土雞蛋、柴雞蛋、笨雞蛋的價格比普通散裝雞蛋（洋雞蛋）高出不少，有的甚至高出一兩倍，但對其營養價值的高低缺乏評價。其中維生素B1（VB1）作為雞蛋中重要的營養物質[5-10]，研究雞蛋中維生素B1的含量對評價各類雞蛋中營養價值是否存在差異具有重要的理論價值和現實意義。維生素B1（VB1），又稱硫胺素或抗神經炎維生素，化學式C12H16N4OS（HCl），是由嘧啶環和噻唑環結合而成的一種B族維生素。VB1具有維持人體正常代謝和生長發育的作用，是人體不可或缺的營養元素[11-13]，成人每天需攝入1～2 mg。VB1在食物中有三種形式[14]，即游離形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸復合物。

目前，VB1的測定方法主要包括熒光分光光度計法[15-16]、微生物法、高效液相色譜法（HLPC）[17-25]和液相色譜-串聯質譜法（HLPC-MS）[26-27]等。熒光分光光度計法耗時、費力，已難以滿足當前分析要求和發展趨勢[15]，不適用于檢測更微量的樣品[16]。微生物法和液相色譜法比較常用，雖然微生物法檢測成本低，具有較高的靈敏度和精確度，但步驟繁瑣、檢測周期長、重復性差，不適用于在較短時間內檢測大量樣品[28]。基于實驗室一般條件，HLPC-MS起點較高，所以本研究采取高效液相色譜法進行雞蛋樣品檢測。目前不同基質中VB1前處理方法有沉淀蛋白法和GB 5009.84—2016（第一法）中樣品酸解和酶解的方法。雞蛋含有大量的維生素、礦物質和蛋白質，基質復雜，目前有必要優化樣品前處理方法，建立一個快速、靈敏、準確的雞蛋中VB1的檢測方法。試驗采用高效液相色譜-熒光法對從市場上采集的不同品牌的60個雞蛋中VB1進行測定。通過優化樣品前處理及色譜條件，建立一種高效、靈敏、準確的檢測方法，分析了市售不同品種雞蛋中的VB1的含量差異，取得了較好的效果，提高了檢測效率和結果的準確性。

1 試驗部分

1.1 材料與儀器

硫胺素鹽酸鹽（純度≥98.6%，Bepure）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團有限公司）；正丁醇（優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活力≥6 000 U/mg，國藥集團有限公司）；alpha-淀粉酶（酶活力≥1 500 U/g，美國Sigma公司）；試驗用水為超純水；其他試劑均為分析純。雞蛋均購自山東省各大超市。方法優化采用的雞蛋經GB 5009.84—2016（第一法）測定結果為1.125 mg/kg。

Agilent 1260高效液相色譜儀配備熒光檢測器（美國安捷倫公司）；pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；Milli-Q超純水制備器（美國Millipore公司）；AB-204S型電子天平（瑞士mettler Toledo公司）；SB-800DTD數控超聲波清洗器（中國寧波新芝生物科技有限公司）；MS3渦旋混合器（德國IKA公司）；GM-300型粉碎機（德國萊馳公司）。

1.2 液相儀器條件

色譜柱：Xbridge C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：0.01 mol/L乙酸鈉溶液-甲醇（80∶20）；熒光檢測器：激發波長375 nm，發射波長435 nm；流速：0.7 mL/min；進樣體積：20 μL；柱溫：35 ℃。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備液（500 μg/mL）：準確稱取5.00 mg的硫胺素鹽酸鹽于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L的鹽酸溶液溶解并定容至容量瓶刻度。

標準工作溶液：將標準儲備液用水逐級稀釋為1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 ng/mL的系列標準工作溶液。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取方式

VB1在食物中有三種形式[14]，即游離形式、硫胺素焦磷酸脂和蛋白磷酸復合物，結合態VB1必須采用酸解或酶解得到游離態，游離態可以直接沉淀蛋白后測定，因此試驗分別考察了沉淀蛋白法、酶解、酸解及其組合模式對雞蛋中VB1的提取效果（圖1和圖2）。

1) 酶解法：稱取5 g粉碎均勻的雞蛋液體于100 mL錐形瓶中，加入適量溫水溶解混勻后，加入0.5 g淀粉酶和0.5 g木瓜蛋白酶，在55 ℃條件下酶解30 min后冷卻至室溫，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調pH至4.0±0.2。

2) 酸解法：稱取5 g粉碎均勻的雞蛋液體于100 mL錐形瓶中，加60 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，充分搖勻，塞上塞子，在120 ℃條件下酸解20 min，冷卻至室溫后取出，用2.0 mol/L乙酸鈉溶液調pH至4.0加減0.2。

3) 酸解酶解法：樣品經與（2）相同的方式酸解后，加入3 mL蛋白酶-淀粉酶混合液（分別稱取1.27 g淀粉酶和1.76 g木瓜蛋白酶，加水定容至50 mL，混勻），在37 ℃條件下酶解16 h后，冷卻至室溫。

4) 沉淀蛋白法：稱取5 g粉碎均勻的雞蛋液體于100 mL錐形瓶中，加入適量溫水溶解混勻后，選擇4種不同的沉淀蛋白法（乙酸鋅-亞鐵氰化鉀沉淀法、5%三氯乙酸沉淀法、甲醇沉淀法、等電點沉淀法）進行沉淀，然后調節試樣溶液的pH至4.0±0.2。

以上四種處理方式后，試樣溶液轉移至100 mL容量瓶中，用水沖洗錐形瓶，洗液合并于容量瓶中，并用水定容至刻度，搖勻后經濾紙過濾，濾液待衍生。

1.4.2 衍生

樣品衍生：準確移取上述濾液5 mL于50 mL離心管中，加入3 mL堿性鐵氰化鉀溶液，渦旋混勻后，準確加入5 mL正丁醇，渦旋混勻1.5 min后離心，吸取正丁醇相（上層）經0.45 μm有機微孔濾膜過濾后，供液相色譜儀分析用。

標準溶液衍生：步驟與樣品衍生相同。

2 結果與分析

2.1 提取方式的選擇

1.4.1 小節中采用四種不同的樣品提取方法，測得雞蛋不同提取方法中的VB1含量和回收率分別見圖1和圖2，樣品加標水平為1.00 mg/kg。結果顯示（圖1和圖2），亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法測定的雞蛋中的VB1明顯偏低，且回收率低于10%，原因可能是雞蛋中部分VB1被這種沉淀法一起包裹沉淀；除亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀法外，其他三種沉淀蛋白法測得的雞蛋中VB1含量和回收率均低于其他三種樣品提取法（酶解、酸解及其組合模式）；只有酸解法和酸解+酶解法的濾液澄清，衍生后分層明顯，無乳化現象，其他幾種提取方法均出現不同程度的乳化現象，原因可能是高溫酸解不僅可以水解蛋白，還有沉淀蛋白等凈化作用。酸解法和酸解+酶解法都經過了高溫酸解，因此濾液澄清，結果無差異。考慮到酸解+酶解法，不僅增加檢驗成本，而且增加了檢驗周期，所以選擇酸解的提取方式。

圖1 不同提取方式對雞蛋中VB1含量的影響

圖2 不同提取方式對雞蛋中VB1回收率的影響

2.2 提取條件的優化

2.2.1 鹽酸濃度的優化

考察了HCl不同濃度（0.01，0.05，0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L）對雞蛋樣品中VB1的提取效果。結果顯示，不同濃度的HCl對VB1的提取效果差異不大，當濃度為0.1 mol/L時，測得雞蛋中VB1的含量最高，所以選擇HCl濃度為0.1 mol/L。

2.2.2 酸解溫度的優化

考察了溫度為30，60，90，120，150和180 ℃對VB1提取效率的影響。研究發現，不同溫度對VB1的提取效果差異不大，當溫度低于120 ℃時，樣品酸解溶液渾濁難以過濾，且衍生后有嚴重的白色乳化現象。鑒于試驗安全，所以選擇最佳酸解溫度為120 ℃。

2.2.3 酸解時間的優化

酸解時間是影響VB1提取的重要因素之一，分別考察了酸解時間為10，20，30，40，50和60 min對提取效果的影響（圖3）。結果表明，40 min內，VB1的提取效率相同，40 min后開始有下降趨勢。由于酸解10 min，樣品酸解溶液不易過濾，所以選擇最佳酸解時間為20 min。

圖3 不同酸解時間對VB1提取的影響

2.3 色譜條件優化

2.3.1 色譜柱的選擇

試驗比較了Xbridge C18柱（4.6×150 mm，3.5 μm）、Atlantis C18柱（4.6×150 mm，5 μm）和Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6×150 mm，4 μm）三種色譜柱的分離效果。結果表明，在選定的條件下Xbridge C18保留分離效果最好，峰型對稱，且峰寬小。原因可能是VB1結構式含有羥基和氨基，衍生后顯堿性，而Xbridge C18專有的端基封尾技術可以確保堿性化合物具有完美的色譜峰形，所以試驗最終選擇Xbridge C18色譜柱進行分離分析。

2.3.2 流動相的優化

2.3.2.1 流動相種類的選擇

經相關文獻[21, 29]調研，高效液相色譜中比較常用的流動相一般為甲醇-乙酸鈉、甲醇-乙酸銨或甲醇-磷酸鹽緩沖溶液，但由于甲醇-磷酸鹽緩沖液體系中磷酸鹽容易造成色譜柱堵塞，所以為了保護色譜柱，選擇甲醇-乙酸鈉和甲醇-乙酸銨緩沖溶液進一步優化。試驗采用處理后的雞蛋樣品上機溶液，考察了在pH 4.0條件下10 mmol/L乙酸銨和10 mmol/L乙酸鈉對VB1分離效果的影響。結果顯示（見圖4A）：流動相為乙酸銨時，峰型展寬，拖尾因子是0.86，峰輕度前伸；流動相為乙酸鈉時，峰寬變窄，峰形變好，呈現高斯對稱，所以試驗選擇乙酸鈉作為后續流動相的優化。

2.3.2.2 流動相濃度的選擇

雞蛋樣品按照2.4小節進行樣品處理，將流動相分別配成5，10，30和50 mmol/L乙酸鈉（pH 4.0），比較VB1分離效果和峰型差異。結果可見（見圖4B）：濃度為5 mmol/L時，VB1峰型展寬，峰前伸；濃度為10，30和50 mmol/L時，VB1的峰型差異不大，峰型較好；考慮到高濃度的鹽會對色譜儀的輸液泵和色譜柱的壽命產生影響，所以試驗選擇乙酸鈉的最佳濃度為10 mmol/L。

2.3.2.3 流動相pH選擇

相關文獻[22]調研，可通過調節流動相的pH來影響其在色譜柱上的保留時間。試驗探討了在相同的流動相組成、比例以及流速條件下，改變流動相pH：采用pH分別為2.0，4.0，6.0，8.0的10 mmol/L乙酸鈉溶液作為流動相進行等度洗脫，考察流動相pH對VB1分離的影響。結果顯示（見圖4C），隨著流動相pH變大，VB1出峰時間延后，反之出峰時間提前；當pH為2.0時，VB1的峰變寬，峰型很差且響應低；當pH為4.0，6.0和8.0時，VB1峰寬變窄，峰型對稱。由于樣品前處理中有VB1衍生過程，其色譜峰圖譜基本無雜峰，考慮到分離效率，試驗最終選擇流動相的pH為4.0。

圖4 流動相的優化

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

將2.3小節中1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 ng/mL的標準工作溶液按照1.4.2小節衍生后，按照1.2小節的液相色譜條件進行測定，以VB1峰面積（Y）對其質量濃度（X）做標準曲線，得到線性方程為Y=46.632 9X-0.221 5，相關系數（R2）大于0.999，線性關系良好。樣品按照1.4小節處理后，逐級稀釋成不同濃度VB1溶液后，經液相色譜儀進行測定，測試其信噪比，分別確定檢出限和定量限。以信噪比S/N=3得到目標物的檢出限（SLOD）為0.015 mg/kg，以信噪比S/N=10得到目標物的定量限（SLOQ）為0.050 mg/kg。標樣譜圖（圖5 A）和樣品譜圖（圖5 B）見圖5。

圖5 標準溶液（100 ng/mL）色譜圖（A）和樣品色譜圖（B）

2.4.2 回收率

將同一份雞蛋樣品分成2份，其中一份作本底，另一份添加適量濃度的VB1標準溶液后按照文章建立的方法進行處理和測定，每份樣品進行6次平行測定，考察方法的回收率和精密度，結果見表1。樣品加標回收率為95.5%～102.0%，相對標準偏差（SRSD）為1.10%～3.21%，可見方法的數據穩定，重現性良好。

表1 方法的回收率與精密度（n=6）

2.4.3 精密度

不同種類雞蛋樣品（山雞蛋、草雞蛋、洋雞蛋、烏雞蛋、土雞蛋）隨機選取一個進行精密度測定，每個樣品分別平行取樣6組，按照1.4小節進行樣品處理，上機測定。樣品中的VB1含量及精密度見表2。結果顯示，精密度小于1.53%，試驗數據穩定。

表2 雞蛋中VB1的含量及精密度

2.5 實際樣品分析

應用此方法對市售的60個不同名稱雞蛋樣品（包括12個山雞蛋、12個草雞蛋、12個洋雞蛋、12個烏雞蛋、12個土雞蛋）進行檢測，通過標準曲線計算其中VB1的含量，檢測結果如下：山雞蛋、草雞蛋、洋雞蛋、烏雞蛋、土雞蛋含量范圍分別為0.121～0.872，0.288～0.808，0.185～0.886，0.316～0.758和0.293～1.15 mg/kg。結果表明：雞蛋中均含有VB1，含量范圍較寬：0.121～1.15 mg/kg；從60批市售雞蛋樣品結果來看，不同種類雞蛋之間VB1含量無明顯差異。

2.6 此方法與國標方法的比較

用此方法和國標法（GB 5009.84—2016）中的第一法同時測定雞蛋樣品，進行比對試驗。樣品結果及加標回收率見表3。結果顯示雞蛋樣品中的VB1含量和國標法測得的結果基本一致，回收率比較滿意，最大相對偏差為3.56%，因此該方法可以用于雞蛋中VB1的檢測。

表3 國標法與本方法的比對結果（n=6）

3 結論

試驗建立了雞蛋中維生素B1的含量檢測研究方法。樣品經HCl高溫酸解提取無需酶解過夜，不僅節約了成本，提高了檢驗效率，而且酸解還有沉淀蛋白的凈化作用。該方法不僅前處理簡單，而且具有較高的靈敏度，檢出限為0.015 mg/kg，定量限為0.050 mg/kg；具有較寬的線性范圍：1～500 ng/mL；具有較好的加標回收率：95.5%～107.8%，可適用于大批量樣品的處理檢測。研究對準確測定雞蛋中維生素B1含量提供了技術支持；對研究不同種類雞蛋品質和營養價值的差異，具有重要的理論價值；對消費者進行雞蛋消費選擇具有重要的現實意義。