鹽堿脅迫下外源油菜素內酯與AM真菌對羊草光合特性及抗氧化酶系統的影響

高戰武，范春燕，鄢上欽，劉金霖，崔艷輝

（1．白城師范學院旅游與地理科學學院，吉林 白城 137000；2．農安縣合隆鎮高級中學，吉林 農安 130216）

在干旱半干旱灌溉區及主要牧場，土壤鹽堿化已成為制約經濟植物產量、土壤健康的關鍵性問題［1］。目前，我國鹽堿地面積超過總耕地面積的30%，且由于土地耕用面積增加及管理措施不足，鹽堿面積仍在不斷擴大，鹽堿化程度也在不斷加劇。

鹽堿脅迫是典型的非生物脅迫之一，其誘導的滲透脅迫、離子失衡和pH脅迫等不利影響可貫穿植物幼苗到成熟各個生長發育環節［2］。在綠色植物中，鹽堿脅迫可對其光化學反應產生不利影響，導致氣孔關閉、胞間CO2濃度增加、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（rubisco）活性降低和活性氧（ROS）積累等［3］。其中ROS脅迫包括超氧陰離子（O2·-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）過量導致碳水化合物、脂質、蛋白質和核酸產生氧化損傷從而嚴重破壞正常代謝［4］。植物擁有各種酶促和非酶促抗氧化劑，可通過不同生化步驟緩解過量ROS累積對細胞帶來的不利影響。其中，超氧化物歧化酶（SOD）是消除超氧自由基的初始酶，其可催化超氧陰離子歧化為H2O2，隨后H2O2被過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）轉化為H2O和O2，從而大幅度緩解脅迫［5］。

叢枝菌根（AM）真菌隸屬于球囊菌亞門，是一類在土壤中廣泛存在的重要功能性微生物，大多數陸地植物可與其建立互惠共生關系，從而更好地應對環境生物/非生物脅迫等［6］。研究表明，鹽堿土仍含有大量AM真菌，它可促進宿主養分吸收、改善根系功能、維持葉片光合效率和降低自由基傷害；此外，AM真菌可穩定植物細胞膜滲透性、增加光合色素、防御復合脅迫、保護細胞內水分等，在增強宿主植物耐鹽堿脅迫能力方面起著重要作用［7］。油菜素內酯（brassinolide，BR）是一類甾醇類激素，它在植物生長發育以及耐逆性方面起著重要作用。研究發現，BR可減輕大豆、甜菜、玉米幼苗發育期間的鹽堿抑制作用［8］，改善垂絲海棠光合特征、熒光參數，增強生物膜的穩定性［9］，同時可通過促進脅迫相關基因的表達，增強酶促抗氧化系統，降低丙二醛和H2O2水平以限制活性氧生成以及保護與葉綠素和光合作用有關的蛋白質［10］。

羊草（Leymus chinensis）是一種多年生根莖無性繁殖的C3植物，廣泛分布于歐亞草原東部、中國東北平原及蒙古高原。它含有相對豐富的微量礦物質、維生素、優質蛋白質及碳水化合物，并且生長迅速、生物量高，因此具有重要的經濟作用和生態價值［11］。目前，關于BR、AM真菌在減輕非生物脅迫方面的功能已被報道，然而關于兩者復合使用對鹽堿脅迫下羊草光合特性及相關生理生化的研究鮮有涉及。基于此，本試驗就BR與AM真菌對鹽堿脅迫下羊草葉綠素含量、光合氣體交換參數、葉綠素熒光參數、相關氧化酶活性及其基因表達的影響進行研究，以期為外源油菜素內酯和AM真菌應用于恢復草地退化提供技術參考。

1 材料與方法

1．1 供試材料

供試吉生三號羊草種子來自吉林省松原市長嶺縣綠園草業公司。種子采用0．5%次氯酸鈉表面消毒5 min，75%酒精再處理5 min，無菌水沖洗5次，之后放在培養皿內濕濾紙上暗處25℃預發芽48 h。

AM真菌為摩西斗管囊霉（Funneliformismosseae），購自北京農林科學院植物營養與資源研究所。菌株采用羊草和白三葉進行擴繁，試驗接種物由孢子（30個/g）、菌絲、根系殘體和土壤組成。供試油菜素內酯（BR），購自SIGMA-ALDRICH公司。

供試土壤取自吉林省松嫩草原生態站內（123°43′52″E，44°44′39″N）0～20 cm表層土壤（未受鹽堿污染），為草甸土。其理化性質為有機質含量22．6 g/kg、全氮1．27 g/kg、全磷0．44 g/kg、堿解氮74．71 mg/kg、有效磷5．63 mg/kg、速效鉀140．09 mg/kg，電導率225．67μS/cm。該區屬溫帶大陸性干旱氣候，年降水量300～450 mm，年均氣溫5℃。土壤去除植物殘體，自然風干后混勻過3 mm網篩，高壓蒸汽滅菌（121℃，1×105kPa，8 h）去除土著AM真菌和其它微生物，冷卻混合后備用。

1．2 試驗設計

試驗于2021年4—7月在吉林省白城師范學院試驗場遮雨塑料大棚中進行，棚內溫度18±2℃。采用完全隨機設計，設置2個接菌方式：不接種（-AM）、接種AM真菌（+AM）和2個油菜素內酯水平：0（-BR）、100μg/L（+BR）［12］，且以上處理皆基于2個鹽堿水平：0（NS）、150 mmol/L（SS）。試驗共8個處理組合，重復5次。其中鹽堿脅迫處理根據東北鹽堿土離子組成模擬鹽堿混合脅迫條件［13］，即將NaCl、Na2SO4、NaHCO3和Na2CO3以摩爾質量比9∶1∶1∶9混合為鹽堿溶液。

盆栽裝置為聚乙烯塑料桶，高19 cm，口徑14．5 cm，底徑12 cm。每盆裝土3 kg，播發芽羊草種子20粒。+AM處理即將30 g AM真菌菌劑接種于羊草種子下方1 cm處，-AM處理即采用滅菌劑，滅菌方式同土壤基質處理。SS處理：培養10 d后，間苗至10株，同時向盆中加入鹽堿溶液100 mL，連續3 d，總用量300 mL；NS處理加蒸餾水。1周后待土壤鹽堿均衡，同一天內分4次向盆中共添加油菜素內酯450 mL。此后，每2周向盆中加入0．5 mol/L Hoagland營養液50 mL且不定時適量加入水分，再培養50 d。試驗共培養70 d。

1．3 樣品采集及指標測定

1．3．1 羊草生物量及根系侵染率、孢子密度、菌絲長度測定 培養結束后，收獲盆中全部羊草，將地上部、地下部分離，置于烘箱中105℃殺青30 min、65℃烘至恒重并稱量記錄。將根系切成1 cm長小段，采用品紅溶液染色，光學顯微鏡下用網格交叉記數法計算菌根侵染率，采用濕式篩分-傾析法測定孢子數，網格線截距法測定菌絲長度，具體操作參照Phillips［14］的方法進行。

1．3．2 羊草光合色素、氣體交換參數和葉綠素熒光參數測定 光合色素（葉綠素a、葉綠素b）采用丙酮-乙醇混合浸提法測定，具體步驟參照高俊鳳［15］的方法。采用LI-6400便攜式光合測定系統測定葉片凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）和氣孔導度（Gs）等指標。葉室溫度設置為25±1℃，CO2濃度為380μmol/mol，光量子密度為1 600μmol/（m2·s）［16］。采用葉綠素熒光儀（WALZPAM-2500，德國PAM-WALZ）測定葉片的熒光動力學參數：初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）及正常光照下的初始熒光（Fo′）、最大熒光產量（Fm′）及穩態熒光（Fs）。葉綠素熒光參數中，PSⅡ的最大光化學效率Fv/Fm＝（Fm-Fo）/Fm，非光化學熒光猝滅系數NPQ＝（Fm-Fm′）/（Fm-Fo），實際光化學效率ΦPSⅡ＝（Fm′-Fs）/Fm′，光化學熒光猝滅系數qP＝（Fm′-Fs）/（Fm′-Fo′）。

1．3．3 抗氧化酶測定 羊草地上部丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸比色法測定，過氧化氫（H2O2）濃度采用三氯乙酸提取-分光光度法測定，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）的測定采用李合生［17］的方法。

1．3．4 抗氧化酶相關基因提取與測定 取樣后，用蒸餾水小心快速沖洗地上部，再用PBS緩沖液沖洗數次，置于干冰保溫箱中，-20℃保存。稱取樣品100 mg，采用液氮快速研磨，使用RNA分離試劑盒（美國Qiagen公司）提取樣品總RNA，采用1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其含量與質量。采用逆轉錄酶M -MLV（RNaseH）催化Prime-ScriptTMRTreagent Kit gDNAr（TaKaRa）反轉錄構建cDNA。

根據目前GenBank序列數據庫公布的羊草（Leymus chinensis）轉錄組序列信息，搜索到抗氧化酶相關的酶基因（Cu/Zn-SOD、CAT、APX）。根據以上基因的序列借助Primer Express 5．0軟件設計擴增引物（表1），看家基因選擇參考Yang等［13］的研究。使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix（Toyobo，Osaka，Japan）和Bio-Rad CFX97實時檢測系統，一式三份進行定量PCR檢測。

實時熒光定量PCR由StepOnePlus Real-Time PCR儀完成。qRT-PCR反應條件參數：保持95℃預變性5 min；95℃熔化變性20 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，循環40次。實時定量試驗結果采用2-△△Ct算法進行相對表達量分析。

表1 qRT-PCR引物序列信息

1．4 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2013整理數據，SPSS 19．0軟件進行三因素方差分析（ANOVA）和鄧肯氏多重比較（P＜0．05），Origin 8．0繪圖。

2 結果與分析

2．1 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草生物量（干重）及菌根發育的影響

圖1A所示，與NS相比，鹽堿脅迫（SS）下羊草地上部、根系及總干重皆整體降低，多達顯著水平。無論NS還是SS條件下，無論菌根定殖與否，施加外源油菜素內酯（+BR）皆整體高于不施加處理（-BR）；無論鹽堿脅迫及油菜素內酯施加與否，接種AM真菌處理（+AM）亦皆顯著高于不接種處理（-AM）。NS條件下，油菜素內酯結合AM真菌處理（+AM+BR）羊草具有最高的根系、地上部和總干物質重，分別為1．27、0．43 g/盆和1．70 g/盆；SS條件下，-BR-AM處理具有最低的根系、地上部和總干物質重，分別為0．94、0．26 g/盆和1．20 g/盆，前者較后者分別提高35．11%、65．38%和42．67%。

收獲時鏡檢，顯示：不接種AM真菌植株根系中未檢測到菌根侵染，接種AM真菌處理根系侵染率、孢子數及菌絲長度見圖1B、C、D。與NS相比，SS處理下根系侵染率（圖1B）及菌絲長度（圖1D）皆受到明顯抑制，孢子數（圖1C）變化不大。無論NS還是SS條件下，+BR處理根系侵染率、孢子數及菌絲長度皆顯著高于-BR處理。其中NS條件下，與-BR 相比，施加油菜素內酯（+BR）根系侵染率、孢子數及菌絲長度分別提高28．57%、8．33%和53．38%（P＜0．05），而SS處理下其增幅更為明顯。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P＜0．05），下同。

2．2 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草光合色素含量的影響

由圖2可知，NS條件下羊草葉綠素b含量整體高于SS，而葉綠素a含量兩者間則波動較小。葉綠素a、葉綠素b含量，NS和SS條件下皆表現為-BR-AM＜+BR-AM＜-BR+AM＜+BR+AM。其中NS條件下，光合色素含量表現為+BR處理高于-BR，其中葉綠素a無顯著差異，葉綠素b則差異顯著；AM真菌處理間，除-BR-AM與-BR+AM處理間的葉綠素a外，其它處理光合色素含量皆為+AM顯著高于-AM。SS條件下，-BR-AM處理葉綠素a、葉綠素b含量皆低于其它處理7．95% ～15．63%、13．89% ～36．73%（P＜0．05）。NS條件下，接種AM真菌導致葉綠素a/b值降低27．11%、9．25%；SS條件下，油菜素內酯施加處理分別降低6．41%、9．11%。

圖2 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草光合色素含量的影響

2．3 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草光合氣體交換參數的影響

由表2可看出，SS條件下所有處理羊草凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）和蒸騰速率（Tr）均低于NS條件下對應處理，而AM真菌處理胞間CO2濃度（Ci）SS則高于NS。與不施加油菜素內酯+非菌根處理（-BR-AM）相比，無論NS還是SS條件下，接種AM真菌、施用外源油菜素內酯處理皆顯著增加羊草葉片Pn、Gs及Tr值，其中NS條件下分別增加13．64% ～24．34%、12．86% ～31．52%及7．75%～21．64%（P＜0．05），SS條件下分別增加22．78%～48．72%、13．60% ～41．95%及12．43%～29．10%（P＜0．05）。NS條件下，Ci以不施加油菜素內酯+非菌根處理（-BR-AM）最低，較其它處理降低6．15% ～11．31%（P＜0．05）；SS條件下Ci則以-BR-AM處理最高，較其它處理增加9．92%～22．80%（P＜0．05）。

三因素方差分析表明，SS×AM和BR×AM相互作用對Pn和Ci有顯著或極顯著影響，而對Gs和Tr則無顯著影響。

2．4 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草葉綠素熒光參數的影響

由表3可知，與NS相比，鹽堿脅迫（SS）導致羊草PSⅡ最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（ΦPSⅡ）和光化學猝滅系數（qP）下降，而非光化學猝滅系數（NPQ）增大。無論是否處于鹽堿脅迫條件下，接種AM真菌處理（+AM）的ΦPSⅡ和qP均顯著高于-AM處理。就PSⅡ最大光化學效率而言，NS、SS條件下，無論油菜素內酯施用與否，與-AM相比+AM處理皆具有較大值，且在油菜素內酯與AM真菌雙處理（+BR+AM）下Fv/Fm值最高，分別為8．56、8．26。NS條件下，+BR+AM處理ΦPSⅡ（0．46）、qP（0．56）亦具有最大值；而鹽堿脅迫（SS）時，-BR-AM處理NPQ值最大，顯著大于其它處理7．98% ～11．66%。

三因素方差分析表明，BR×AM相互作用對ΦPSⅡ、qN和NPQ有顯著影響，對Fv/Fm無顯著影響。

表2 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草光合氣體交換參數的影響

表3 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草葉綠素熒光參數的影響

2．5 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草抗氧化酶活性、MDA含量及H2O2濃度的影響

由圖3A～D可見，無論鹽堿脅迫及油菜素內酯施用與否，接種AM真菌（+AM）較-AM大多顯著增加羊草地上部超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性，皆增加抗壞血酸過氧化物酶（APX）及谷胱甘肽還原酶（GR）活性；而無論鹽堿脅迫及AM真菌接種與否，施用油菜素內酯（+BR）較-BR增加羊草地上部SOD、CAT、APX及GR活性，且大多達到顯著水平。

圖3E、F顯示，與NS相比，鹽堿脅迫（SS）均顯著增加羊草H2O2濃度和MDA含量。就接種AM真菌（+AM）而言，SS條件下施用油菜素內酯（+BR）較-BR具有較低的H2O2濃度和MDA含量，NS下則無顯著差異。就施用油菜素內酯（+BR）而言，SS條件下接種AM真菌處理較-AM降低羊草MDA含量和H2O2濃度，且后者顯著差異，但NS條件下沒有顯著影響。SS條件下，+BR處理H2O2和MDA含量顯著低于-BR。

2．6 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草抗氧化酶相關基因表達的影響

由圖4可見，鹽堿脅迫（SS）皆明顯提高羊草Cu/Zn-SOD、CAT及APX基因表達水平，尤其是Cu/Zn-SOD基因。其中，NS條件下Cu/Zn-SOD基因（圖4A）以-BR-AM處理表達水平最低，低于其它處理26．98%～33．33%（P＜0．05）；SS條件下，BR處理（-BR、+BR）、AM處理（-AM、+AM）之間皆存在顯著差異，仍以-BR-AM處理表達水平最低，其它處理較其顯著增加134．09%～186．36%。NS條件下，CAT基因（圖4B）表達水平BR處理（-BR、+BR）間差異顯著，AM 處理（-AM、+AM）間-AM+BR、+AM+BR處理差異不顯著；SS條件下，BR處理（-BR、+BR）、AM 處理（-AM、+AM）之間皆差異顯著，其中-BR-AM處理表達水平最低，較其它處理降低36．36%～57．57%（P＜0．05）。各處理APX生物合成基因表達水平的規律與CAT基因基本一致。

圖3 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草抗氧化酶活性（A～D）、丙二醛含量（E）及H2O2濃度（F）的影響

圖4 鹽堿脅迫下BR與AM真菌對羊草抗氧化酶Cu/Zn-SOD、CAT、APX基因表達水平的影響

3 討論與結論

土壤鹽堿化是農牧業生產面臨的主要問題之一。它通過抑制一系列生理生化機制以限制植物的生長發育［2，18］。植物生物量積累及分配是評估其資源獲取和環境適應策略的重要功能參數。本研究結果表明，鹽堿脅迫可顯著降低羊草地上部、根系及總干重，同時接種AM真菌可顯著降低鹽堿誘導的生長抑制，這與之前的研究結論一致［19］。油菜素內酯（BR）作為一種新的植物生長促進劑，被認為與植物應對非生物和生物脅迫有關［10］。本研究中，無論是NS還是SS（鹽堿脅迫）條件下，施用油菜素內酯其生物量積累皆明顯高于不施處理，此外，與單一-BR或-AM處理相比，油菜素內酯結合AM真菌接種處理（+BR+AM）羊草的地上部、根系和總干重亦更高，表明BR可促進AM真菌的功能作用。鹽堿脅迫（SS）下，-BR處理羊草根系侵染率、孢子密度及菌絲長度皆顯著降低，+BR處理菌根生長指標與NS條件下相當；同時無論NS還是SS條件下，+BR處理根系侵染率、孢子密度及菌絲長度皆明顯增加。前人研究表明，在共生過程中植物激素是影響AM真菌發育的重要因子，目前已發現獨腳金內酯、生長激素及赤霉素等是影響菌根共生的植物激素［6，20］。本研究結果從側面說明油菜素內酯亦是影響AM真菌發育的功能激素之一［21］。

近年來，葉綠素熒光已被廣泛用于闡述亞細胞和葉片發育水平的光合作用的組裝、功能和適應化指標［22］。而光合色素含量和光合氣體交換參數是決定光合作用強度及進程的重要生理前提，包括當植物暴露于鹽堿脅迫時的氣孔開合及自然條件下類囊體光合調節［23］。本研究中，鹽堿脅迫條件下羊草葉綠素a+b含量整體下降，而葉綠素a含量基本不變。前人研究指出，影響內囊體吸收、傳遞光能的光合色素主要為葉綠素b，說明影響光合色素含量（尤其是葉綠素b）也是鹽堿脅迫影響植物生長的重要參數。同時接種AM真菌羊草色素含量明顯增加，這可能是由AM真菌可改善宿主營養水平所致［24］。本研究進一步表明，鹽堿脅迫下光合氣體交換參數（Pn、Gs、Tr）和葉綠素熒光參數（Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP）更低，胞間CO2濃度（Ci）及非化學淬滅系數（NPQ）更高。就本研究的光合指標試驗數據來看，無論是NS還是SS條件下，BR處理（-BR、+BR）間以+BR較大，AM處理中以+AM大于-AM，同時各處理皆表現為-BR-AM＜+BR-AM＜-BR+AM＜+BR+AM。NPQ反映PSⅡ反應中心吸收的光能無法用于光合電子傳遞，而以熱能形式損失掉的光能部分［25］。這些結果表明，鹽堿脅迫導致氣孔關閉進而增加細胞內CO2濃度也是其對植物產生的不利影響之一，而外源性油菜素內酯、AM真菌可以調節氣孔打開，有助于PSⅡ光系統并減輕菌根植物中鹽堿脅迫引起的光合作用抑制［26］。

正常條件下，植物細胞內活性氧（ROS）的產生和清除之間保持動態平衡［27］，而生物/非生物脅迫下ROS會過度積累從而導致氧化酶應激及脂質過氧化。作為ROS中含量最高的物質之一，H2O2參與植物生長、發育及脅迫響應等一系列過程［28］。本研究發現，鹽堿脅迫顯著提高H2O2濃度，接種AM真菌、施用外源油菜素內酯可減輕鹽堿脅迫引發的H2O2積累水平。膜損傷是應激條件下脂質損傷的必然結果［29］，丙二醛（MDA）濃度通常被認為是細胞膜穩定性的重要表征［30］。本研究中，鹽堿脅迫下油菜素內酯處理大多顯著降低羊草H2O2濃度和MDA含量，同時AM真菌接種和油菜素內酯結合處理下MDA含量最低。結合菌根發育指標，本研究表明油菜素內酯可以減少菌根植物中活性氧過度積累引起的膜損傷，進一步說明它對AM真菌發揮作用具有正向疊加作用。

油菜素內酯作為一種天然甾醇類激素，其生理活性遠超生長素、赤霉素、細胞分裂素等五大功能激素，是一種活性最高效、廣譜、無毒的植物激素，目前已發現其可通過清除過多的ROS從而降低氧化應激帶來的細胞損傷［31］。本研究顯示，鹽堿脅迫下接種AM真菌、施用油菜素內酯處理羊草抗氧化酶（SOD、CAT、APX和GR）活性皆較高，其抗氧化酶生物合成基因（Cu/Zn-SOD、CAT、APX）表達水平亦較高。無論是否接種AM真菌，施用外源油菜素內酯皆提高羊草體內Cu/Zn-SOD、CAT和APX基因的表達水平，并且接種AM真菌情況下抗氧化酶合成基因表達水平皆最高。這些結果表明施用油菜素內酯在提高菌根羊草體內的抗氧化酶活性以維持細胞活性氧在較低水平方面起著重要作用。

綜之，本研究中接種AM真菌、施用油菜素內酯皆可有效改善羊草生長、保障光合進程及減輕鹽堿脅迫帶來的細胞損傷。油菜素內酯可促進AM真菌生長發育，鹽堿脅迫環境下，兩者結合使用效果更佳。其潛在機制可能是，改善AM真菌生長、保護光合色素、維持光合生理、激活抗氧化酶活性以及降低脂質過氧化和ROS累積。