羊糞有機肥對洛陽植煙土壤微生物群落結構和功能的影響

李正輝，殷全玉，馬君紅，孟祥瑞，李麗華，周俊學，王玉潔，劉國順，石秋環

（1．河南農業大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2．河南省煙草公司洛陽市公司，河南 洛陽 471000）

化肥是重要的農業生產資料，有利于農作物增產增收，但長期過量施用化肥會導致肥料效應報酬遞減，地力下降［1，2］，土壤生物活性降低，從而制約產量品質形成［3，4］。適量施用有機肥能夠優化土壤耕層結構，改善植煙土壤理化性狀，為微生物生長提供良好生境［5］。但是有機肥養分釋放緩慢，作物生長發育對養分需求量大，僅施用有機肥無法滿足需要。研究表明，化肥配施有機肥可以改善土壤理化特性，促進土壤團聚體形成，改善土壤微生物群落結構［6］，又可以滿足作物對養分的需求［7］，降低病害發生［8］。

微生物是土壤生態系統健康的重要指標［9］，相比土壤理化指標，微生物能夠更快速表征土壤質量變化。何冬冬等［10］研究發現，土壤類型為砂壤土時，有機肥改變了真菌群落結構，土壤中腐生營養型真菌的比例顯著提升，稻草配施化肥能夠有效降低長期輪作的土傳病害風險并提高土壤肥力。趙力光等［11］研究認為，降低化肥比例，配施生物有機肥能夠改善土壤微生物區系，同時降低病原菌數量。楊宇虹等［12］使用Biolog ECO平板分析法研究表明，農家肥最有利于土壤微生物的生長，有機肥次之，復合肥效果最差。李棟宇等［13］利用砂壤土使用Biolog ECO平板分析法進行研究表明，有機、無機肥配施顯著提高土壤微生物多樣性、均一性指數，與單施化肥相比提高了85%～310%。馬宜林等［14］研究發現，等量施肥條件下羊糞有機肥與無機肥配施比率影響了煙株地上部生長發育和根系構建，在洛陽丘陵褐土區配施40% ～60%羊糞有機肥更有利于滿足烤煙的需肥規律，改善煙株生長，維持煙區土壤肥力。

河南省是典型濃香型煙葉產區，洛陽是河南煙葉主產區之一，有機肥對煙草生產起著重要作用，餅肥是傳統的煙用有機肥，可以顯著改善煙草質量，但價格較貴。羊糞價格低廉，在洛陽煙區有較為穩定和豐富的來源。本試驗以餅肥和羊糞作為有機肥原料，均以50%的比例與無機肥氮配施，探究其對洛陽植煙土壤微生物群落結構和功能的影響，以期為煙田土壤改良和科學施肥提供依據。

1 材料與方法

1．1 試驗材料與試驗地概況

試驗于2019年在河南省洛陽市洛寧縣小界鄉王村煙草試驗站（34°26′N，111°38′E）進行，該地屬丘陵地帶，年平均氣溫13．7℃，年降水量600～800mm，土壤質地為褐土，土壤基礎肥力：速效磷30．29mg/kg，速效鉀129．36 mg/kg，速效氮80．50 mg/kg，全碳0．89%，全氮0．14%，pH 7．51。洛陽主栽品種LY1306作供試煙草。

1．2 試驗設計

試驗共設4個處理，不施肥（CK）、單施化肥（T1）、50%餅肥氮+50%化肥氮（T2）、50%羊糞有機肥氮+50%化肥氮（T3）。除CK外，其余處理施氮量均為45 kg/hm2，每個處理4次重復，小區面積80 m2，地邊設2行保護行。氮磷鉀比1∶2∶3，試驗用羊糞有機肥、餅肥、煙草專用復混肥、重過磷酸鈣和硫酸鉀根據當地習慣在4月1日一次性條施，5月4日移栽，5月13日追施硝酸鉀肥75 kg/hm2，條施。各處理其他管理方式一致，9月底采收完成。

1．3 土壤微生物取樣與分析

土壤樣品采集：烤煙移栽70 d后采用五點取樣法采集煙草根系周圍土壤樣品，混合均勻，剔除植物殘體等雜質，迅速用干冰冷藏土樣，帶回實驗室后過2 mm篩，-80℃保存。

土壤DNA 提取和PCR 擴增：根據E．Z．N．A．?soil DNA kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U．S．）說明書進行土壤總DNA提取，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，使用NanoDrop 2000測定DNA濃度和純度；采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16S rRNA基因V3-V4可變區進行PCR擴增，使用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對ITS基因ITS1可變區進行PCR擴增。PCR反應體系：5×TransStart FastPfu緩沖液4μL，dNTPs（2．5 mmol/L）2μL，上游引物（5mol/L）0．8μL，下游引物（5 mol/L）0．8μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0．4μL，模板DNA 1μL，ddH2O補足至20μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共27個循環；72℃延伸10 min。4℃保存。

Illumina Miseq測序：將同一樣本的PCR產物混合，使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳后利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行產物回收、純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTMFluorometer（Promega，USA）對回收產物進行檢測。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進行建庫：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）磁珠回收PCR產物得到最終文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。原始數據上傳至NCBI SRA數據庫。

數據處理方法：使用fastp［15］軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH［16］軟件進行拼接：（1）過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N 堿基的reads；（2）根據PEreads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成一條序列，最小overlap長度為10 bp；（3）拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0．2，篩選不符合序列；（4）根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

使用UPARSE［17］軟件，根據97%［18］的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDPClassifier［19］對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數據庫（version 138）和UNITE 8．0 ITS database數據庫，設置比對閾值為70%。

1．4 數據處理與統計分析

采用Microsoft Excel 2019整理數據，利用DPS軟件的LSD法（P＜0．05）做處理間差異性分析，選擇97%相似度的OTU進行alpha多樣性分析，采用LEfSe軟件根據分類學組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析（LDA），Qiime計算beta多樣性距離矩陣，利用R語言工具統計和作圖，利用PICRUSt軟件對細菌OTU進行功能預測，利用FUNGuild微生態工具按營養方式對真菌進行功能預測。

2 結果與分析

2．1 植煙土壤微生物群落alpha多樣性分析

2．1．1 稀釋曲線 對16個土壤樣本（4個處理×4次重復）測序，每個處理的測序數量均超過40 000條，細菌群落聚類劃分后得到6 564個OTU，歸類于38個門133個綱312個目505個科975個屬1 980個種；真菌群落聚類劃分后得到1 954個OTU，歸類于16個門43個綱94個目234個科490個屬778個種。

圖1 土壤細菌（a）和真菌（b）群落多樣性稀釋曲線

稀釋曲線（圖1）表明，隨著測序數量的增加，稀釋曲線趨于平穩，增加測序數量并無新物種出現，說明測序數量達到飽和，當前測序量能夠反應樣本的真實情況。

2．1．2 alpha多樣性指數 對不同處理的土壤微生物群落OTU進行alpha多樣性分析，分別用Chao1指數（物種豐富度估量值）、Heip指數（群落均勻度指數）、Shannon指數（多樣性指數）、Simpson指數（多樣性指數）4個常用度量指標探究各處理內微生物群落結構特征。由表1可知，與餅肥處理（T2）相比，羊糞有機肥處理（T3）降低了煙草土壤細菌群落結構的多樣性和豐富度，OTU數量有所減少，但提高了土壤真菌群落結構的多樣性和均勻度。

表1 各處理alpha多樣性指數

2．2 植煙土壤微生物群落組成

土壤樣品在門水平上檢測到9種相對豐度大于1%的細菌，其中有4種相對豐度大于10%，相對豐度占總量超過80%。如圖2所示，土壤細菌優勢門為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteriota）。與T1處理比較，T2和T3處理放線菌門的相對豐度均有所提升，表現為T2（39．9%）＞T3（38．5%）＞T1（36．4%）；變形菌門相對豐度處理間表現為T3（18．1%）＞T2（16．2%）＞T1（15．7%）；酸桿菌門相對豐度表現為T1（15．3%）＞T3（12．8%）＞T2（12．6%）。與單施化肥相比，有機肥配施化肥增加了放線菌門和變形菌門的相對豐度，降低了酸桿菌門的相對豐度，其中餅肥處理放線菌門豐度增加更為顯著，羊糞有機肥處理變形菌門豐度增加幅度較大。

土壤樣品中檢測到的相對豐度大于1%的真菌有5個門，其中子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）的相對豐度大于10%。與T1處理相比，T2和T3處理土壤中子囊菌門的相對豐度分別提高了12．7%和10．0%；被孢霉門的相對豐度表現為T1（16．8%）＞T3（12．5%）＞T2（9．2%）。與單施化肥相比，有機肥配施化肥增加了子囊菌門的相對豐度，降低了被孢霉門的相對豐度（圖3）。

圖2 細菌在門水平上的相對豐度

圖3 真菌在門水平上的相對豐度

在科水平上，相對豐度大于1%的細菌共有26個，其中微球菌科（Micrococcaceae）、JG30-KF-CM45、地嗜皮菌科（Geodermatophilaceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）相對豐度大于5%。餅肥處理和羊糞有機肥處理土壤中的微球菌科、地嗜皮菌科和鞘脂單胞菌科相對豐度高于不施肥和僅施化肥處理（圖4）。

在科水平上，相對豐度大于1%的真菌共有19個，其中綠藻科（Piskurozymaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）、木蘭科（Mrakiaceae）、發菌科（Trichocomaceae）、從赤殼科（Nectriaceae）和毛殼菌科（Chaetomiaceae）的相對豐度大于5%。T2和

T3處理土壤中綠藻科和被孢霉科相對豐度低于CK和T1，其中T2和T3處理的被孢霉科相比CK分別降低了7．9%和4．3%；T2處理木蘭科的相對豐度顯著高于CK和T1；T2處理中發菌科顯著富集，相對豐度達30%以上，明顯高于其余處理；T3處理的從赤殼科相對豐度明顯高于其他處理（圖5）。

2．3 LEfSe多級物種差異判別分析

2．3．1 細菌LEfSe多級物種層級樹和LDA判別結果 LEfSe是一種用于發現高維生物標識和揭示基因組特征的軟件。LEfSe采用線性判別分析（LDA）估算每個組分（物種）豐度對差異效果影響的大小。從門水平到屬水平各個分類單位設定LDA閾值為3。由圖6可知，CK處理擬桿菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌綱（Bacilli）等顯著富集；T1處理紅色桿菌綱（Rubrobacteria）、紅色桿菌目（Rubrobacterales）等顯著富集；T2處理樣本中放線菌門（Actinobacteriota）、放線菌綱（Actinobacteria）、Frankiales目等顯著富集；T3處理樣本中鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、丙酸桿菌目（Propionibacteriales）等顯著富集。

2．3．2 真菌LEfSe多級物種層級樹和LDA判別結果 從門水平到屬水平各個分類單位設定LDA閾值為3。由圖7可以看出，CK主要優勢菌群為被孢菌門（Mortierellomycota）、被孢菌目（Mortierellales）、被孢菌綱（Mortierellomycetes）等；T1的優勢種群為新赤殼屬（Neocosmospora）、Paramyrothecium屬等；T2的優勢菌群為發菌科（Trichocomaceae）、黃色籃狀菌屬（Talaromyces）、散子囊菌目（Eurotiales）等；T3的優勢菌群為糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、葡萄座腔菌目（Pleosporales）等。

圖4 細菌在科水平上的相對豐度

圖5 真菌在科水平上的相對豐度

圖6 細菌LEfSe多級物種層級樹圖（a）和LDA判別結果（b）

圖7 真菌LEfSe多級物種層級樹圖（a）和LDA判別結果（b）

2．4 植煙土壤微生物群落beta多樣性分析

基于Bray-Curtis距離對4個處理的土壤微生物群落組成進行NMDS分析。由圖8a（細菌NMDS分析圖）可以看出，T3和T2處理細菌群落組成均與CK和T1存在明顯差異，說明羊糞有機肥和餅肥處理改變了土壤細菌群落組成，但二者間有相似之處也有差異；由圖8b（真菌NMDS分析圖）可知，CK和T1的組成較為相似，T2和T3處理與其有較大差異。說明有機肥配施化肥可以改變真菌的菌群結構，但羊糞有機肥和餅肥的效果又有所不同。

2．5 功能預測

通過PICRUSt軟件對細菌OTU信息進行功能預測，得到COG功能分析圖（圖9），不同施肥處理土壤相對豐度大于5%的功能基因包括能量生產與轉化（energy production and conversion）、氨基酸轉運與代謝（amino acid transport and metabolism）、碳水化合物的運輸與代謝（carbohydrate transport and metabolism）、翻譯核糖體結構和生物發生（translation，ribosomal structure and biogenesis）、轉錄（transcription）、細胞壁/膜/包膜生物發生（cell wall/membrane/envelope biogenesis）、無機物運輸和代謝（inorganic ion transport and metabolism）。各個處理之間關于細菌功能的差別不明顯。

圖8 土壤細菌（a）和真菌（b）NMDS分析圖

圖9 細菌COG功能豐度統計function柱形圖

圖10 真菌FUNGuild功能分類統計結果

利用FUNGuild微生態工具，對真菌群落進行功能預測，如圖10所示，各處理按照環境資源的利用途徑分成病理營養型（pathotroph）、腐生營養型（saprotroph）兩個功能分類，對營養類型進一步分類得到多種功能。與T1處理相比，T2處理未定義腐生菌（undefined saprotroph）的相對豐度增加；T3處理明顯增加了土壤動植物病原菌（animal pathogen-endophyte-lichen parasite-plant pathogensoil saprotroph-wood saprotroph，animal pathogenplant pathogen-undefined saprotroph）相對豐度，降低了腐生營養型真菌（undefined saprotroph，endophyte-litter saprotroph-soil saprotroph-undefined saprotroph），但其中糞腐生菌（dung saprotroph）相對豐度顯著高于其他處理。

3 討論與結論

土壤微生物是土壤微生態的重要組成成分，影響土壤理化特性，參與土壤養分循環，改善土壤肥力［20-23］，對維持土壤質量及促進植物生長等有重要作用。豐富的微生物群落多樣性可以緩解煙田連作障礙，提高土壤有機質含量，釋放促進農作物生長的有益元素，從而影響農作物的生長發育［24，25］。

3．1 羊糞有機肥配施化肥對根際土壤細菌群落結構和功能的影響

相比餅肥，羊糞有機肥處理改變了細菌群落的alpha多樣性，土壤OTU數量減少，細菌多樣性和豐富度有所降低。對細菌群落柱形圖和LEfSe層級圖進行分析可知，相比單施化肥，羊糞有機肥處理使土壤放線菌門的相對豐度有所提升，放線菌能夠有效分解動植物殘體，供給土壤養分［26］；變形菌門的相對豐度顯著高于其他處理，變形菌門是細菌中的重要成員，有固氮作用，同時和土壤速效養分密切相關［27］。羊糞有機肥土壤酸桿菌門的相對豐度和餅肥處理接近；餅肥和羊糞有機肥處理土壤中微球菌科、地嗜皮菌科和鞘脂單胞菌科相對豐度有所提高，這說明有機肥可以改變優勢細菌種類，這與Ren［28］、蔣雨洲［29］等的研究結果一致。從土壤細菌NMDS分析圖可以看出，T2和T3處理細菌群落結構相對于CK和T1處理有明顯差別，說明有機肥配施化肥可以改變細菌群落結構，但餅肥和羊糞有機肥對群落結構的影響有相同之處也有不同之處。施肥對煙草根際土壤細菌的功能類群改變不明顯。

3．2 羊糞有機肥配施化肥對根際土壤真菌群落結構和功能的影響

相比不施肥處理，施肥增加了土壤真菌群落的OTU數量；相比餅肥處理，羊糞有機肥處理的多樣性和均勻度有所提高。由真菌群落柱形圖和LEfSe層級圖可以看出，與T1處理相比，T2和T3處理土壤子囊菌門的相對豐度分別提高了12．7%和10．0%，子囊菌門可以促進動植物殘體的分解［30］；被孢霉門的相對豐度均有所降低。羊糞有機肥處理土壤樣品的從赤殼科和糞殼菌綱顯著富集，而綠藻科和被孢霉科有所降低。從真菌NMDS圖可以看出，羊糞有機肥處理和餅肥配施化肥處理都對真菌微生物群落結構影響明顯，但餅肥和羊糞有機肥的影響并不相同。羊糞中含有大量的有機質，利于真菌的生長，真菌能夠分解動植物殘體、動物糞便等有機質使其能被植物吸收利用［31］。真菌的富集說明羊糞有機肥增強了土壤的分解能力，更利于植物自身吸收營養物質，推動了腐殖化進程。從真菌功能類群上看，羊糞有機肥處理腐生營養型真菌的相對豐度有所降低，增加了動植物病原菌的相對豐度，在利用羊糞進行土壤改良時，應尤其注意進行充分腐熟或者與功能菌共發酵，形成生物羊糞有機肥加以利用。

有機肥可以通過對微生物群落的影響進而影響土壤健康。本研究發現，羊糞有機肥配施化肥和餅肥配施化肥都可以改變土壤微生物群落結構多樣性和功能類群，但餅肥成本較高，羊糞有機肥價格低廉，更具有推廣優勢，但在應用中應加強對病原菌的防控。