蕎麥根際微生物的分離及生物活性檢測

張婉麗，趙雅慧，吉慧敏，王東勝

（山西師范大學生命科學學院，山西 太原 030031）

蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench），又稱烏麥、三角麥，為蓼科蕎麥屬草本植物。蕎麥原產于中國，主要分布在北方以及西南地區，如陜西、內蒙古、云南、四川。蕎麥富含蛋白質、維生素、礦物質、黃酮類物質等，對許多疾病有一定的預防效果，是一種兼備食用與藥用的優良作物。隨著社會經濟的發展，人們保健意識的增強，包括蕎麥在內的一些小雜糧需求量不斷增大。雖然我國蕎麥種植面積居世界前列，但單位面積產量（850 kg/hm2）相較其他國家卻很低［1-3］。已有學者通過育種技術［4］以及轉基因技術［5］對提高蕎麥產量進行研究，但從根際微生物方面改善蕎麥生長條件卻鮮有報道。

根際概念最早于1904年由德國科學家Lorenz Hiltner提出，指緊貼于根系的薄層土壤，該處土壤由于受到根系生長代謝的影響，表現出與周圍土體不同的理化性質。生長在根際土壤中的微生物稱為根際微生物［6］。根際是植物與土壤進行交互作用的關鍵點，根際微生物在植物生長和土壤養分循環中的作用已成為近年來微生物的研究熱點［7-9］。大量研究表明，植物-根際微生物互作對植物健康生長起著重要作用，根系通過富集周圍土壤的特定菌群，造成根際微生物多樣性低于非根際土壤，但數量卻高于非根際土壤［10］。植 物 的 類 型［11］、生 育 時 期［12］、生 長 環境［13］均會對根際微生物的種類組成及生態分布產生影響。同時，根際微生物可以通過促生機制、生防機制來促進植物生長。如溶磷菌可以將環境中難溶無機磷轉換成植物可吸收形式促進種子萌發，增加干重［14］；鏈霉菌通過拮抗病原菌降低黃瓜立枯病發病率，提高種子發芽率，促進幼苗生長［15］；此外，根際微生物還可以影響氮的有效性，將色氨酸轉換為吲哚乙酸調控植物開花時間，以此進一步促進植物生長［16］。

目前我國許多地區存在過量及不平衡施肥等問題，一方面會污染環境，使得土壤理化性質發生改變，土體質量下降，農產品品質受到影響，另一方面還會增加農戶生產成本（化肥占生產總物資費用50%左右）［17］。根際益生菌是菌肥的主要菌種來源，在可持續農業發展中有著巨大的應用潛力。隨著生物技術的發展，將有益微生物制作成菌肥來代替一部分化肥越來越成為可能。馬軍妮［18］用婁徹氏鏈霉菌和密旋鏈霉菌制成放線菌菌劑，可提高幼苗總鮮重、葉片凈光合速率和根系誘導酶活性，增強小麥抗逆性、穗粒重等。周冬梅［9］從擬南芥根際中篩選出兩株具有抗旱能力的菌株Burkholderia sp．ARD10和Mitsuaria sp．ARD17，均具有產生EPS和ACC脫氨酶的能力，經過對玉米的促生試驗發現，在干旱條件下能顯著提高葉片含水量、脯氨酸積累量以及過氧化物酶（POD）活性，還可提高玉米在干旱脅迫中的激素含量，從而提高干旱耐受性。目前有關蕎麥根際微生物的報道很少，因此本試驗以蕎麥為研究對象，從其根際土壤篩選出具有抗菌活性、解磷活性及產蛋白酶和淀粉酶能力的菌株，旨在篩選出具有促生功能的有益菌并開發成菌肥，從而促進蕎麥增產和綠色農業發展。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

土樣來自晉蕎（苦）5號根際，蕎麥于2020年10月26日采自于山西省晉中市太谷縣侯城鄉孟家莊村（112．595583°E，37．439568°N，海拔769～830 m），密度90萬株/hm2。樣品于-80℃保存。

1．2 試驗方法

1．2．1 樣品預處理 輕輕抖落掉與蕎麥根系附著不緊密的土壤，將根與附著土壤一起稱重后，放入90 mL無菌水中洗凈撈出，擦干稱重，兩者重量之差即為根際土壤重量（0．5 g），根際土壤溶液記作10-2。將根際土壤溶液放入錐形瓶搖床振蕩30 min使其充分混勻，使用移液管吸取1mL轉入裝有9 mL無菌水試管中，記作10-3，依次稀釋為10-4、10-5。

1．2．2 根際微生物的分離純化 采用稀釋平板涂布法進行分離。細菌涂布于牛肉膏蛋白胨培養基（BPA）［19］，放線菌涂布于高氏一號（GA）［19］、TWYE［20］、ISP2［21］培養基，稀釋梯度均選取10-3、10-4、10-5。真菌接種于馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）［19］，稀釋梯度選取10-2、10-3、10-4。每個梯度3個重復，共45（5×3×3）個平板。置于28℃恒溫箱中，細菌培養2～3 d，真菌培養3～4 d，放線菌培養7～8 d。挑取形態、大小不同的菌株采用平板劃線法進行純化，重復2～3次，直至出現單菌落。編號后于斜面中保藏備用。

1．2．3 生物活性檢測

（1）菌株活化：將保藏真菌接種于PDA培養基中進行活化；細菌、放線菌分別涂布于BPA、GA培養基中進行活化，完成后用6 mm直徑打孔器打孔備用。

（2）抗菌活性檢測：供試病原菌均由山西師范大學微生物實驗室提供，分別為大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、青霉菌（Penicillium sp．）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。在接種靶標菌的試管中注入適量無菌水，輕輕抽提攪拌，制成懸菌液。使用移液管將病原細菌懸菌液滴至BPA培養基中，病原真菌滴至PDA培養基中，用涂布器均勻涂開。

放線菌和真菌采用瓊脂塊法［19］：28℃培養1～2 d，觀察是否產生透明圈，并記錄透明圈直徑。細菌采用對峙法［22］：28℃培養1 d，觀察十字交叉處靶標菌的生長情況。

（3）酶活性檢測：培養基為H1-1培養基［23］，放線菌和真菌采用瓊脂塊法，28℃培養2～3 d；細菌采用點接法［24］，37℃培養1～2 d。檢測蛋白酶活性時，可直接觀察透明圈；檢測淀粉酶活性時，滴加適量碘液后觀察菌落周圍是否產生透明圈。

（4）解磷活性檢測：采用點接法，培養基為磷酸鈣固體培養基［25］，28℃培養3～4 d，觀察透明圈。

1．2．4 菌種鑒定 對所篩選廣譜活性菌株進行鑒定，由上海派森諾基因科技有限公司完成。將所測真菌序列利用NCBI數據庫進行BLAST（https：//blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi）比對，所獲細菌、放線菌序列利用EzBioCloud（https：//www．ezbiocloud．net/）數據庫進行比對，篩選相似度較高序列通過MEGA 10．2．5軟件進行系統發育分析。

2 結果與分析

2．1 蕎麥根際微生物的種類及數量

蕎麥根際土壤中富含大量微生物，共分離出72株菌，其中放線菌39株、真菌18株、細菌15株。從表1可看出根際微生物中細菌數量最多，約為6．2×108cfu/g，其次是放線菌，約為（3．7～7．1）×107cfu/g，真菌數量最少，約為3．7×105cfu/g。GA培養基分離得到的放線菌種類最多，占放線菌總數目的43．6%；ISP2培養基的分離種類最少。

表1 蕎麥根際土壤微生物數量

2．2 蕎麥根際微生物的抑菌活性

由表2可知，對酵母菌、青霉、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有拮抗活性的分別有23、5、3、25株。放線菌的拮抗活性較好，在拮抗各靶標菌總數中分別占82．6%、100．0%、66．7%、76．0%。透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值越大，透明度越高，證明其拮抗活性越好，其中4株放線菌SI16、SG15、SG22、ST1-1的抗菌活性較好，均具有3種抗菌活性（表3）。

表2 不同種類菌株拮抗活性篩選結果

表3 4株放線菌對4種靶標菌的拮抗能力

2．3 蕎麥根際微生物的酶活性

以可溶性淀粉、脫脂奶作為篩選底物，對72株菌進行功能酶活性篩選，其中有15株菌具有蛋白酶活性，占比20．8%；14株菌有淀粉酶活性，占比19．4%；同時具有兩種酶活性的有4株，占比5．6%。對具有蛋白酶活性的菌株測量其透明圈，D/d值越大，透明度越高，證明其活性越高。從表4中可看出SB1、SG13、SG15的蛋白酶活性較好，從表5中可看出SI21、SG2-2、SG15、ST1-1、ST1-2的淀粉酶活性較好。

表4 蕎麥根際微生物蛋白酶活性篩選結果

表5 蕎麥根際微生物淀粉酶活性篩選結果

2．4 蕎麥根際微生物的解磷活性

以Ca3（PO4）2作為難溶性磷酸源，篩選具有解磷活性的菌株，試驗共發現10株菌（細菌、真菌）具有解磷活性，占比13．9%。從表6中可看出，菌株SB16、SB3-2、SP5解磷效果較好。

表6 蕎麥根際微生物解磷活性篩選結果

2．5 廣譜活性菌株的鑒定

通過對72株菌進行生物活性檢測，發現SG15的活性最好，具有5種活性；有3株菌（SI16、SG9、ST1-1）具有4種活性，7株菌（SB2、SP1、SP12、SG2-2、SG16、SG22、ST1-2）具有3種活性，18株菌具有2種活性，20株菌具有1種活性，分別占比1．4%、4．2%、9．7%、25．0%、27．8%（圖1）。三種菌中，放線菌的生物活性最好，有活性菌株占總放線菌株的82．1%，占總活性菌株的65．3%，因此放線菌是一類重要的微生物資源。將具有3種及以上活性的菌株列為廣譜活性菌株，對細菌、真菌和活性最強的5株放線菌進行鑒定，結果（圖2）表明，放線菌均為鏈霉菌屬，SI16、ST1-1、SG9、SG15、SG22分別與Streptomyces acidiscabies（D63865）、Streptomyces parvus（AB184756）、Streptomyces canus（KQ948708）、Streptomyces coacervatus（AB500703）、Streptomyces paradoxus（AB184628）相似度為99．79%、99．86%、99．86%、98．51%、100．00%。細菌SB2為芽孢桿菌屬，與Bacillus inaquosorum（AMXN01000021）相似度為99．65%。系統發育分析顯示真菌SP1、SP12聚為一簇，均為鐮刀菌屬，但其形態明顯不同，所以可能為不同亞種，還需進一步研究（圖3）。

圖1 蕎麥根際72株菌的生物活性篩選結果

圖2 基于16S rRNA基因序列的N-J系統發育樹

圖3 基于ITS序列的N-J系統發育樹

3 討論與結論

自然界土壤中富含大量微生物，實驗室條件下的可培養微生物只占很小一部分，未來可通過共培養技術、改善生長條件等獲取更多的微生物資源。植物-有益微生物互作對雙方均是有利的，根系分泌物可為微生物提供營養來源，而微生物可通過拮抗病原菌、固氮、解磷、解鉀、產酶、產植物激素等幫助植物改善生長條件，獲取更多養分。不同植物種類、土壤環境、大氣條件都可對根際微生物產生影響［9，26］。將有益微生物應用于農業生產有利于改善生態環境及提高經濟效益，因此開發未知微生物資源十分重要。

本研究發現放線菌與細菌、真菌相比，生物活性較好，有活性菌株占放線菌總數82．1%，可見放線菌是一類具有重要價值的微生物資源。GA、ISP2、TWYE三種培養基分離的放線菌數量與種類有所不同，ISP2培養基分離數量最多，GA培養基分離的種類最多，因此改變培養基成分可能會對分離效果產生影響。王東勝等［27］向GA培養基添加CaCl2，結果發現某些土樣放線菌數量顯著減少，但新種類有所增加。因此后期試驗可通過改變培養基成分獲取蕎麥根際更多的放線菌資源。

對于拮抗活性檢測，放線菌的抑菌效果最為顯著，有活性菌株占放線菌總數69．2%，占蕎麥根際總菌株37．5%，且篩選到4株菌同時具有3種拮抗活性。這可能與放線菌可產生大量抗生素有關，抗生素可通過干擾病原菌細胞壁合成、改變細胞內部代謝等來拮抗病原菌。事實上，大部分抗生素都是由放線菌產生的，朱榮貴等［28］從塔里木盆地分離得到18株稀有放線菌，其中14株具有抗生素合成基因。放線菌對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）比對革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）的抑制力要強，這可能是因為革蘭氏陰性菌存在外排泵可降低細胞內抗生素含量，從而降低其敏感性［29］。枯草芽孢桿菌因其天然無害、性能優良，已大量應用于動物飼料中［30］。本試驗中芽孢桿菌SB2可拮抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，與已有報道一致［31］；另外菌株SB2還具有良好的解磷活性。微生物來源的蛋白酶與淀粉酶因其種類豐富、生長條件易控等特點在工業上得到廣泛應用［32，33］。放線菌SG15的蛋白酶與淀粉酶活性均較好，具有較高的應用潛力。具有解磷活性的菌株中，細菌占比最多（占總解磷菌株70．0%），真菌次之，未檢測到有放線菌具有解磷活性，與前人報道［34］相似，具體解磷機制尚不清楚。有研究顯示以磷酸鈣作為磷源，溶磷圈直徑大小并不能代表菌株真實解磷能力［35］，因此試驗還需進一步對解磷菌株在液體培養基中的解磷能力進行測定。

蕎麥根際存在豐富的微生物資源，本研究篩選到11株具有廣譜生物活性的微生物菌株，后續可用于開發功能菌肥。