長期連作及強還原土壤滅菌處理對烤煙根際土壤真菌群落的影響

饒德安，劉潘洋，鄒路易，滕 躍，郁紅艷*，尹光庭

（1.江南大學，江蘇 無錫 214122；2.河南中煙工業有限責任公司，河南 鄭州 450018）

烤煙（Nicotiana tabacumL.）作為重要的經濟作物，是卷煙工業的主要原料，其質量和產量在煙草生產中起著至關重要的作用［1-2］。受耕地資源、經濟利益和栽培習慣等因素影響，宜煙地區連作現象普遍［3］，導致植株發育不良，煙葉產、質量下降，吸食安全性降低［3］，造成每年經濟損失高達40億元［4］，嚴重影響了煙草產業可持續發展。

根際微生態失衡可能是連作障礙發生的主要原因［5-6］。土壤微生物群落的改變可以改變群落的功能，進而反應在植物的生長和發育方面。此外，由于微生物群落與土壤條件和土地管理的密切關系，其可作為土壤健康的生物指標［7］。許自成等［8］研究發現，長期連作導致烤煙根際土壤真菌菌群結構發生變化，致病菌增多。She等［9］研究連作12年的烤煙根際土壤時發現微生物OTU、Shannon、Pielou evenness和Chao1等指數與對照相比顯著下降。Wang等［10］報道了烤煙連作顯著降低了根際土壤有益細菌和真菌的相對豐度。作為土壤微生物區系的重要成員，土壤真菌與其他微生物一起參與土壤生態系統中物質循環和能量流動，包括碳、氮、磷和硫的循環，以及為植物提供營養等［11-12］。相反，真菌也可引起烤煙作物的土傳病害［13-14］，導致烤煙根、莖和葉的生長發育受阻［15］。

強還原土壤滅菌法（RSD）是一種在作物種植前的土壤處理方法，采用淹水+悶棚+有機物料的方式，阻隔土壤與大氣氣體交換，創造土壤強烈還原條件，短期內殺滅土傳病原菌［16］。目前，強還原土壤滅菌方法是防治土傳病害和消除連作障礙廣泛應用的新方法。周開勝［17］在西瓜連作土壤中發現RSD處理可明顯抑制致病尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf. sp. niveum）生長，西瓜的發病率和死亡率顯著低于對照組。朱同彬等［18］在研究連作黃瓜地時，發現RSD處理與未處理對比，顯著改善了土壤理化性質并且提高了黃瓜的產量。Butler等［19］報道了RSD對多種土傳病原菌有殺菌效果，如番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumSchlechtend）、白娟病菌（Sclerotium rolfsiiSacc）等。RSD對連作土壤具有良好的修復效果，但在烤煙土壤中的應用與效果卻少有報道。

受限于技術手段，對煙草根際真菌群落的研究目前主要集中在群落組成、多樣性以及接種內生菌上［20］。FUNGuild是一個進行真菌功能比對的數據庫，對真菌進行具體的功能分類。本研究聯合使用Illumina高通量測序技術［21］和FUNGuild，研究不同連作年限及RSD處理下對烤煙根際土壤真菌群落的影響，旨在為烤煙根際真菌群落的變化和緩解烤煙連作障礙提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與試驗設計

試驗于2019年9～11月在河南省襄城縣汾陳鄉（113°31′ E， 33°58′ N）進行。該地區主要氣候類型為大陸季風氣候，年平均氣溫約為14.7℃，年降水量約為453.13 mm，土壤類型為黃褐土。選取連續種植3年“中煙100”的煙田，采用淹水添加可溶性糖溶液覆膜法創造強還原環境，修復烤煙連作土壤，共設置2個處理：連作未處理（3年）和強還原處理（RSD），每個處理3組平行，共6個小區，小區面積為2.4 m×3 m，各個小區之間設置保護行，間距3 m。具體處理方法為：每個小區淹水至飽和，均勻投加糖溶液（0.5%添加量，糖溶液/土壤），覆蓋6絲地膜，60 d后揭膜，自然晾曬7 d。于2019年11月對上述小區土壤進行取樣，同時在試驗區采集烤煙連作3、5、7年根際的土壤。所有土樣于冰盒中保存，運回實驗室，分為兩部分，一部分置于室內自然風干用于測定土壤理化性質，一部分置于-80℃冰箱保存用于提取DNA。

1.2 土壤理化性質測定

土壤理化性質按如下方法測定。土壤pH（水土質量比為2.5∶1）使用pH計（Starter 3100，上海奧豪斯儀器有限公司）測定。土壤總碳（TOC）和總氮（TN）由C/N元素分析儀（Vario-micro，德 國Elementar公 司）測 定［22］。總 磷（TP）由硫酸-鹽酸消解，鉬藍比色法測定。總鉀（TK）由HF-HClO4消解，ICP-OES（Optima8300，美國PerkinElmer有限公司）測定［23］。所有結果均按

105 ℃烘干土重量計算。

1.3 土壤DNA提取及PCR擴增

土壤總DNA使用DNeasy PowerSoil試劑盒（QIAGEN GmbH， Germany），根 據 試 劑 盒 說 明提取。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，NanoDrop 2000（賽默飛世爾科技有限公司）檢測DNA純度和濃度，真菌18S⒚SSU0817F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物對V5～V7可變區進行PCR擴增，采用GeneAmp? 9700型（美國ABI公司）PCR儀，使用反式Gen AP221-02（反式啟動FastPfu DNA聚合酶），反應體積為20 μL，包括4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mol/L dNTPs、0.8 μL正向和反向引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶、0.2 μL BSA，模板DNA 10 ng，適量ddH2O，27次循環周期的PCR程序如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃45 s，最后在72 ℃下延伸10 min，10 ℃直到儀器停止。2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物。Axy-PrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）提取PCR產物，Tris-HCl洗脫產物。純化后的產物經QuantiFluorTM-St-blue熒光定量系統（Promega公司）定量，然后根據測序量的要求進行混合，最后由上海美吉生物制藥技術公司（中國上海）完成測序。

1.4 Illumina測序及序列處理

使用Illumina MiSeq PE250測序平臺對擴增產物進行雙端測序。測序數據經過Flash和Trimmomati進行拼接和質控后，使用微生物生態學定量研究平臺QIIME（Quantitative Insights into Microbial Ecology）進行處理。使用UCLUS對各序列在97%的相似性水平下聚類操作分類單位（OTUs），各個OTU的代表序列使用UNITE數據庫（https：//unite.ut.ee/）進行物種信息比對。

1.5 數據處理與分析

真菌的功能分組使用FUNGuild 1.0進行比對，FUNGuild是一款通過微生態Guild對真菌群落進行分類分析的工具，其基于目前已發表的文獻或權威網站數據，對真菌進行功能分類，主要步驟為：（1）將QIIME輸出的OTU表和物種信息表合并，將物種信息附加在OTU表的最后一列并命名為“taxonomy”；（2）將第（1）步得到的表格上傳到FUNGuild 網站，開始比對；（3）比對完成后下載輸出結果到本地。輸出結果包含原始的OTU表，并依據序列數量進行排序。運用R 3.5.1分析土壤理化性質與真菌群落的相關性，繪制相關性熱圖。相關性熱圖可根據顏色梯度的變化直觀看出各指標與菌種之間的相關性，顏色梯度由紅色到綠色表示相關性由近到遠。樣本的描述性分析、組間差異的顯著性分析使用SPSS 19.0中的獨立t檢驗完成。圖片由Origin 9.1制作。顯著性檢驗水準均為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 長期連作及RSD處理對烤煙根際土壤理化性質的影響

對不同連作年限及RSD處理的烤煙根際土壤理化性質分析（表1）可知，隨著連作年限的增加，pH呈顯著下降趨勢，其中連作5和7年處理顯著低于其他處理；連作處理TOC呈下降趨勢，未達到顯著水平，RSD處理較未處理（3年）顯著提升TOC含量；連作7年處理總氮含量呈顯著下降，RSD處理較未處理（3年）顯著提升總氮含量；總鉀、總磷含量在各處理間無顯著變化。表明長期連作導致土壤質量退化，養分比例失衡。

表1 連作及RSD處理對烤煙根際土壤理化性質的影響

2.2 長期連作及RSD處理對真菌群落多樣性和結構的影響

對各樣品中測序得到的OTU進行分類表明，所有樣品共得到478個OTU，整體上隨連作年限呈明顯上升趨勢。與未處理（3年）相比，RSD處理降低了OTU數量（圖1）。4個處理中共有的OTU為65個，其中3年、5年、7年、RSD處理中特異的OTU分別為9、13、27、6個；連作處理樣品中特異的OTU隨著連作年限呈上升趨勢，其中RSD處理降低特異OTU 數量（圖2）。

圖1 不同處理真菌OTU數量

圖2 不同處理特異OTU數量韋恩圖

本試驗中，各處理的覆蓋率都在99.98%以上，表明本次測序結果接近樣本中微生物的實際情況，可進行Alpha多樣性分析。ACE、Jack指數代表真菌群落豐富度，Shannon、Invsimpson指數代表真菌群落多樣性。由圖3可知，其豐富度指數，連作7年處理顯著高于其他處理，連作3、5年處理間無顯著差別，RSD處理較未處理（3年）顯著降低群落豐富度指數；連作3和7年處理Shannon指數無顯著差異，顯著高于連作5年處理，RSD處理顯著低于未處理（3年）；Invsimpson指數在連作處理下呈升高趨勢，但未達到顯著水平，RSD處理顯著低于未處理組（3年）。

圖3 不同處理真菌Alpha多樣性指數變化

對測序結果主坐標分析發現（圖4），前兩個主坐標的方差貢獻率分別為43.14%和33.47%。在第1主坐標排序中，所有處理可分為連作7年處理、連作3和5年處理、RSD處理3組，在第2主坐標排序中，RSD處理與連作3和5年處理顯著分離。表明連作達7年后根際土壤真菌群落結構發生顯著變化；RSD處理較未處理（3年）顯著改變群落結構。由聚類分析（圖5）可知，在距離0.025處，可將RSD處理聚為一類，連作處理聚為一類。進一步表明RSD處理較未處理（3年）顯著改變群落結構。

圖4 不同處理真菌主坐標分析

圖5 不同處理真菌層級聚類分析

2.3 長期連作及RSD處理對真菌群落相對豐度的影響

由圖6統計分析發現，Sordariomycetes相對豐度隨連作年限呈先下降后上升的趨勢，但5、7年處理與3年處理相比都顯著下降，與未處理（3年）相比，RSD處理使其相對豐度升高；連作處理Dothideomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes和Intramacronucleata相對豐度逐年升高，連作年限時間愈長，升高幅度愈大，與未處理（3年）相比，RSD處理使其相對豐度顯著下降；連作處理下Mucoromycetes、Agaricomycetes呈先升后降的趨勢，與未處理（3年）相比，RSD處理使其相對豐度顯著升高；Tremellomycetes相對豐度在各處理下無顯著變化。結果顯示，各處理土壤樣品中真菌綱水平相對豐度發生顯著變化，表明長期連作及RSD處理顯著影響真菌群落結構。

圖6 不同處理真菌綱水平相對豐度變化

進一步對相對豐度排名前20的真菌屬分析發現，連作處理導致Chaetomium、Solicoccozyma、Plectosphaerella相對豐度先降低后上升，RSD處理與未處理（3年）相比顯著降低Solicoccozyma、Plectosphaerella相對豐度；連作處理顯著提高Fusarium、Cladosporium、unclassified-Pleosporales、norank-Leotiomycetes、Aspergillus、Colpoda、unclassified-Onygenales的相對豐度，與未處理（3年）相比，RSD處理降低其相對豐度，其中Fusarium相對豐度下降達顯著水平（P＜0.05）；連作導致norank-Mucoromycota、norank-Pyronemataceae、Sistotrema先增加后降低，RSD處理較未處理（3年）顯著增加其相對豐度；連作處理顯著降低unclassified-Microascaceae、Phymatotrichopsis相對豐度，除unclassified-Microascaceae、norank-Aphelidea外，RSD處理較未處理（3年）顯著降低其相對豐度；norank-Aphelidea、norank-Helotiales、Hypocrealla、norank-Pezizaceae、norank-Sordariomycetes相對豐度在各處理下無顯著變化。

表2 不同處理真菌屬水平相對豐度變化 （%）

2.4 長期連作及RSD處理對不同功能真菌相對豐度的影響

將測序結果與FUNGuild真菌數據庫進行比對，在測定的所有土壤樣本中主要發現4種功能真菌（表3）。統計分析表明，連作處理顯著提高烤煙根際土壤植物病原菌的相對豐度，與未處理（3年）相比，RSD 處理顯著降低連作處理植物病原菌的相對豐度；植物內生菌相對豐度隨著連作年限呈先下降后上升的趨勢，連作5年處理其相對豐度明顯低于其他處理，但未達到顯著水平；連作處理下外生菌根相對豐度無顯著變化，與未處理（3年）相比，RSD 處理顯著提高外生菌根相對豐度；各處理下動物病原菌相對豐度無顯著變化。表明連作顯著改變了植物功能菌的相對豐度，RSD處理對其具有良好修復效果。

表3 不同功能真菌相對豐度變化 （%）

2.5 真菌群落與環境因子相關性熱圖分析

由圖7可知，Solicocozyma相對豐度與根際土壤總氮含量呈顯著負相關，Cladosporium、unclassified-Pleosporales、norank-Leotiomycetes、Colpoda、Fusarium、Aspergillus、unclassified-Onygenales的相對豐度與根際土壤pH、有機質和總氮的含量呈顯著負相關；Sistotrema和norank-Zoopagomycota相對豐度與根際土壤pH、有機質和總氮的含量呈顯著正相關；Pyronemataceae與根際土壤總鉀含量呈顯著正相關，norank-Aphelidea與根際土壤總鉀、總磷含量呈顯著正相關。

圖7 真菌群落與環境因子相關性熱圖分析

3 討論

3.1 長期連作導致烤煙根際土壤質量退化

前人在研究烤煙［24-25］、草莓［26］、黃連［27］和水稻［28］等連作時發現，土壤pH和養分隨著連作年限顯著下降，且連作年限愈久，土壤質量退化愈嚴重。本研究表明，長期連作導致烤煙根際土壤pH、土壤總碳和總氮顯著下降，說明長期連作烤煙導致土壤質量退化。根際土壤pH的降低可能是由于長期連作導致根系釋放的化感物質大量累積導致的［29-30］。土壤總碳和總氮含量顯著降低可能是因為烤煙在長期連作的脅迫下，為保證其生長發育和內在品質，選擇性吸收大量元素［31］。土壤總碳具有保水保肥、促進土壤團聚體形成、改善土壤物理性質等作用［32］，因此，總碳在保持土壤質量和作物生產力方面起著關鍵作用。氮是植物生長發育必不可少的元素，Lisuma等［31］發現氮素影響煙葉的顏色、口感、煙氣和香氣，進而影響煙葉的內在品質。同時氮是蛋白質的組成元素，在植物體內合成各種結構和酶［33］。缺氮會導致葉綠素含量［34］、同化能力、酶活性和酶含量下降［33，35］，進而導致植物生物量和質量的下降。本研究結果表明，總磷和總鉀長期連作無顯著變化，其歸因于豫中煙區常年施肥模式，為追求高產量和優質煙葉，煙農忽視養分平衡，大量施用鉀肥和磷肥。

3.2 長期連作導致烤煙根際土壤真菌群落顯著變化

長期連作導致烤煙根際土壤微生態偏向真菌型［3，36］。張笑宇等［37］研究烤煙輪作與連作時發現連作煙田真菌數量顯著高于輪作煙田，進一步分析微生物群落結構發現連作煙田根腐病病菌Pythium相對豐度較高。許自成等［8］研究發現長期連作烤煙導致土壤真菌群落結構發生變化，腐霉科、盤菌科和鐮刀菌屬等致病菌增多。Liu等［38］在研究其他旱作作物長期連作時發現了11種潛在病原真菌，大多數潛在病原真菌的相對豐度顯著增加。本研究結果發現，長期連作烤煙導致根際土壤真菌群落豐富度指數和多樣性指數顯著上升，群落結構顯著變化；Fusarium［14］、Cladosporium［39］、Plectosphaerella［40］等是已知植物病原菌，Pleosporales目中有些真菌易引起嚴重的植物病蟲害［41-42］，而Aspergillus在果實病害、采后病害［43-44］以及秋葵病蟲害中均有報道［45］，烤煙連作顯著促進上述5種菌種的相對豐度。同時FUNGuild數據庫比對結果發現，長期連作導致植物病原菌相對豐度顯著增加，外生菌根真菌相對豐度顯著下降，表明長期連作導致致病菌增多，有益微生物減少。前人研究表明，土壤質量能夠直接或間接影響微生物群落，土傳病害是由于連續單作導致土壤質量退化而發生的，土壤微生物群落對環境變化反應迅速，與土壤條件和土地管理密切相關［6］。潘義宏等［15］研究云煙105時發現，土壤營養趨于協調、健康，降低了土傳病害的發病率。馬少蘭等［46］研究連作枸杞地時發現土壤pH、電導率、硝態氮和有效磷含量是解釋再植枸杞根際真菌群落變化的主要因素。葉浩等［47］研究貴州煙區時指出pH與烤煙土傳病發病率呈負相關。土壤有機質含量與有益細菌呈正相關［48］，與土壤疾病發病率呈負相關［49］，這可能表明土壤有機質在疾病抑制中具有潛在作用［50］。本研究也得到類似的 結 果，Fusarium、Cladosporium、Plectosphaerella等已知植物病原菌以及unclassified-Pleosporales和Aspergillus相對豐度與pH、總碳和總氮呈顯著負相關，表明長期連作導致pH、總碳和總氮含量下降是真菌群落病原菌增多、群落結構變化的主要因素。在豫中煙區實際生產中，大量施用磷肥、鉀肥，導致磷、鉀元素過量，碳、氮元素匱乏，長期土壤養分失衡導致烤煙根際微生態惡化。

越來越多的研究表明，連作過程中，根際分泌物不會累積到直接毒害作物的濃度，往往通過影響病原菌萌發、繁殖等造成連作障礙［51］。病原菌的相對豐度逐年增加，可能的原因是根際分泌物為其提供了基質，導致連作系統中大量病原菌富集。桑正林等［52］研究發現，烤煙在生長發育前期通過根系分泌較多的單糖到根際土中，為土壤中黑脛病菌的生長發育提供了物質和能源，促進了煙草黑脛病菌的生長；Morris等［53］發現大豆根系分泌異黃酮可以吸引一種病原菌；Hao等［54］還發現西瓜的根系分泌物促進了病原菌的生長。

3.3 RSD處理修復烤煙根際土壤

強還原土壤滅菌法（RSD）已被廣泛應用于作物連作系統中。朱同彬等［55］研究表明RSD應用于設施蔬菜系統中，可有效消除硝酸鹽和硫酸根，顯著提高土壤pH。周開勝［17］研究發現強還原滅菌法應用于西瓜連作土壤中能有效殺死病原菌。本研究發現，RSD處理顯著提高土壤總碳和總氮含量，改善土壤質量。RSD通常選取易降解的有機物料作為碳源添加，大部分有機物料都取得了較好的滅菌效果，但是呈現差異性，這與有機物料本身理化性質有很大關系，如易降解碳和難降解碳的比重、碳氮比等。有研究指出，雖然RSD處理選用易降解的有機物料，但由于施用量大、純度高，處理后仍有相當數量的有機物質殘留在土壤中，成為土壤有機質的一部分，可提高土壤有機質含量、改善土壤結構［56］。有學者指出，經RSD處理后蔬菜地土壤氮的轉化過程發生顯著變化，加快無機氮周轉速率，提高氮的有效性［16］。本研究中選用的有機物料為蔗糖和玉米粉混合糖溶液，含有大量碳、氮元素，增加根際土壤總碳和總氮含量。本研究中RSD處理對pH無顯著影響，蔡祖聰等［16］研究表明，對于酸化土壤經過強烈還原處理后，pH均大幅度提高，隨有機物料施用量的增加而升高。但是，對于并未酸化的土壤，RSD處理對pH的影響很小，在處理過程中由于有機酸的生成甚至可能使土壤pH有所下降。

本試驗中，RSD處理顯著降低真菌群落OTU數量、多樣性指數和豐富度指數，改變真菌群落結構，降低Fusarium、Cladosporium、Plectosphaerella等已知植物病原菌以及unclassified-Pleosporales和Aspergillus等可能引起植株、果實病害菌種的相對豐度，表明RSD處理對烤煙連作土壤真菌群落具有一定的修復效果。其原因可能如下［16，56-59］：首先，烤煙致病菌大多數為好氧菌，RSD處理創造強烈的厭氧環境使得這些病原菌無法生存；其次，有機物料厭氧發酵產生對土傳病原菌有毒有害的物質，如有機酸、氨氣、硫化氫和生物活性物質等，殺滅土傳病原菌。當RSD處理結束時，這些有毒有害物質可以快速分解或快速再氧化，一般其濃度已經下降至對作物無害的程度。

本試驗結果表明，RSD處理較未處理（3年）顯著提高總碳和總氮含量。主坐標軸分析和聚類分析表明，RSD處理較未處理（3年）顯著改變真菌群落結構。FUNGuild數據庫比對分析表明，RSD處理較未處理（3年）顯著降低植物病原菌相對豐度（降低46.08%）。整體來講，RSD處理對連作3年烤煙根際土壤質量具有良好的修復效果，對真菌群落具有一定的修復效果。溫度對強還原滅菌處理效果顯著影響，且溫度越高修復效果越好［18］。前人的研究通常在作物休耕一年或種植休閑期，選取夏季高溫時間（5～8月）進行試驗［17-18］。本試驗中考慮到當地煙農經濟收入，并未休耕，RSD處理時間選為烤煙作物收獲之后（9～11月）進行。溫度較前人試驗較低。再者，對不同連作年限根際土壤分析發現，連作年限時間愈長，土壤質量和真菌群落惡化程度愈嚴重。本試驗選取連作3年煙田（考慮到豫中煙區實際生產中，以連作3年最為普遍）進行RSD處理，其對真菌群落修復效果一般。由圖3～5分析可知，RSD處理與5、7年處理差異程度很大，RSD處理對連作年限超過3年的煙田可能具有良好的潛在修復效應。

4 結論

烤煙長期連作導致根際土壤質量顯著退化；測序結果表明，連作促進根際土壤真菌群落Alpha多樣性水平升高，真菌群落結構變化，病原菌豐度增加，當連作年限達5年時，其變化達到顯著水平；土壤質量退化導致根際土壤病原菌增多可能是豫中煙區連作障礙的主要原因之一。RSD處理對烤煙連作土壤的質量具有良好的效果，對真菌群落具有一定的修復效果。如果烤煙作物休耕1年，選取夏季高溫天氣作為RSD修復時間，將取得更好的修復效果。同時，選取連作年限較長（＞3年）的煙田作為RSD處理樣地，可能具有更好的修復效果。