土層置換對連作土壤微生物及再植幼苗的影響

段亞楠，陳學森，沈 向，姜遠茂，尹承苗，毛志泉

（山東農業大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點試驗室，山東 泰安 271018）

蘋果是我國山東部分地區主要的經濟農作物，由于土地和水源有限，栽培模式單一，隨著栽植年限的增加，連作障礙現象普遍發生且危害嚴重［1］。連作障礙是指即使在正常水肥管理下，也會出現植株生長衰弱、矮化、葉片小，甚至植株死亡等現象［2-3］，前人研究表明生物因素是引起連作障礙現象發生的主導因素［4-5］。

通過對山東省蘋果園土壤養分狀況的研究發現，由于果樹的長期定植及化肥農藥的過量施用，有機質含量顯著降低，土壤中一些有益微生物的生長受到抑制，數量減少，以鐮孢屬為代表的有害真菌數量增加，土壤微生物群落結構由高肥的細菌型向真菌型轉變，從而影響新栽幼苗生長［6-8］，而土層置換技術是近年來逐漸興起的一種農業耕種措施，可以改變原有的土壤結構，有效消除土壤農藥殘留對作物的毒害作用，從而達到穩產、高產的目的［9］。宮秀杰等［10］研究表明土層置換可以有效改良松嫩平原北部鹽堿地的土壤理化性狀，降低0～40 cm耕層土壤容重，提高土壤含水量，促進根系生長，提高產量。周旺明等［11］研究發現在多次凍融交替過程中，土體的膨脹和收縮會釋放出小分子有機質等，導致土壤微生物種群數量及結構發生改變，土壤微生物群落由C/N較高的真菌群落轉變為C/N較低的細菌群落，但土層置換這一方法在防治蘋果連作障礙方面的研究鮮有報道。本試驗從土層置換這一防治方法出發，以平邑甜茶幼苗和嫁接苗為試驗材料，研究土層置換對連作條件下幼苗生長、土壤微生物數量、凈光合速率及土壤陽離子交換量等指標的影響，以期為老齡蘋果園更新提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于蒙陰、萊州和棲霞三地25年生老齡蘋果園進行，土壤基本理化性質見表1。2012年12月15日，在這三地果園進行果園清理及挖溝處理，在每個果樹原行位置挖2條100 cm×50 cm×60 cm的溝，并將0～30和30～60 cm 2土層土壤攤開放置，取土樣作為冬前土。2013年3月15日，將年前挖的溝回填，回填時分為原位回填（CK）和土層置換（SLR）2個處理，回填時嚴格處理，做好位置標記，并取土樣作為冬后土。

表1 三地老齡果園土壤基本理化性質

2013年清明節前后栽植2年生蘋果嫁接苗，砧穗組合為煙富3號/M9T337，購自萊州大自然園藝科技有限公司。栽植株行距為1.5 m×4 m。2013年4月25日，在回填后2條溝的位置定植平邑甜茶（Malus hupeheusisRehd.）幼苗，每個處理20個重復。

分別于2013年5、7、9月取土樣，觀察土層置換以后各土層土壤微生物數量的動態變化情況。2013年和2014年9月測定幼苗生物量，觀察處理對再植幼苗生長的影響。

供試材料為平邑甜茶實生苗。2013年1月10日將平邑甜茶種子于4 ℃層積30 d左右，待種子露白后，播種于裝有育苗基質的營養缽中進行育苗，當幼苗長至6片真葉時選取長勢一致、無病蟲害的植株進行栽植。

蒙陰、萊州和棲霞三地果園分別記做M、L和Q；0～30和30～60 cm土層的土樣分別記做A和B；原位回填處理和土層置換處理分別記做CK和SLR。

1.2 測定指標

用卷尺、游標卡尺和電子天平分別測定幼苗株高、地徑、干鮮重，干樣需將樣品置于信封袋中，在108 ℃的烘箱中殺青30 min，然后在80 ℃烘至樣品恒重。總枝長，每處理選擇3株樹，每株樹的枝條使用軟米尺測量長度；百葉重，每處理隨機抽取5株樹，每株樹隨機采集20片正常葉，共100片，稱百葉重。

采用CIRAS-3便攜式光合儀（PP System，英國）測定氣體交換參數。選擇晴天無風的9：00～11：00，測定時光強穩定約為1100 μmol/（m2·s），溫度為（25±1）℃，空氣中CO2濃度為（380±10）μmol/mol，相對濕度變化范圍為58%～62%，每個處理選取3株長勢一致植株的第4片健康功能葉，測定其凈光合速率、氣孔導度、胞間CO2濃度、蒸騰速率等光合參數。

土壤中細菌、真菌、放線菌的數量均采用平板涂布稀釋法測定，測定前計算水分系數。細菌采用酵母膏蛋白胨瓊脂培養基，真菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，放線菌采用高氏一號培養基［12］。所有數據最后通過測定各自的土壤含水量換算成每克干土的含量，每克樣品含菌數=［菌落平均數×稀釋倍數］/［接種量×（1-含水量）］［13］。

土壤鐮孢菌基因拷貝數的測定參照王曉寶等［5］的方法，使用E.Z.N.A.?土壤DNA提取試劑盒提取土壤DNA，用CFX96TM Thermal Cycler（Bio-Rad）測定。

土壤陽離子交換量的測定參照魯如坤［14］的乙酸銨法。

參照鮑士旦［15］《土壤農化分析》（第3版）的方法，對土壤氮、磷、鉀和有機質進行測定。有效磷用鉬銻抗比色法；速效鉀用火焰光度法；有機質用重鉻酸鉀容量法（稀釋熱法）；銨態氮和硝態氮（NH4+-H和NO3--N）用CaCl2浸提流動注射分析儀法。

土壤pH的測定：稱取過1 mm篩的鮮土樣10 g，將土壤與中性水以1∶2.5的比例攪拌混勻，放置30 min后用酸度計進行測定。

土壤質地的測定：根據美國制土壤分類標準，采用微吸管法［16］。

1.3 數據處理

采用Excel 2003進行數據處理和作圖，采用SPSS 19.0進行統計分析，采用鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 土層置換對平邑甜茶幼苗生物量的影響

由表2可以看出，三地老齡蘋果園土壤經過土層置換（SLR）后，平邑甜茶幼苗的株高、地徑、鮮重和干重均高于原位回填（CK）處理，其中以棲霞果園效果最顯著，其土層置換（QSLR）后平邑甜茶幼苗的株高、地徑、鮮重和干重分別是原位回填處理（QCK）的1.42、1.17、1.27和1.25倍。

表2 土層置換對平邑甜茶幼苗生物量的影響

2.2 土層置換對富士/M9T337嫁接幼苗生物量的影響

表3反映了原位回填（CK）和土層置換（SLR）處理對連作嫁接幼樹在2013到2014年生長的影響。結果表明，土層置換（SLR）處理可以顯著提高連作嫁接幼樹的株高、地徑、總枝長、鮮重和百葉重。其中以棲霞果園效果最顯著，與平邑甜茶幼苗趨勢一致。具體表現為：在2013和2014年，土層置換（SLR）處理后的株高分別提高了11.69%和23.48%，地徑分別提高了27.61%和34.71%，總枝長分別提高了46.83%和62.51%，鮮重分別提高了52.19%和68.57%，百葉重分別提高了5.97%和5.61%。

表3 土層置換對富士/M9T337嫁接幼苗生物量的影響

2.3 土層置換對老齡蘋果園土壤微生物的影響

2.3.1 土層置換對老齡蘋果園土壤真菌的影響

由圖1可以看出，三地老齡蘋果園土壤凍融后，各土層真菌數量均顯著降低；但經過原位回填和土層置換處理后，三地上下層土壤真菌數量變化趨勢不同，三地果園土壤原位回填處理后，上層土壤（CKA）真菌數量先趨于穩定，降低后再增加；下層土壤（CKB）真菌數量先增加，降低后再趨于穩定。而下層土置換到上層后（SLRB）土壤真菌數量先升高，然后呈下降趨勢；上層土置換到下層后（SLRA）土壤真菌數量先增加，最終趨于穩定。土層置換后9月數據結果表明，蒙陰、萊州和棲霞三地土壤上層土置換后（SLRA）真菌數量均顯著降低，分別降低了28.1%、18.2%和18.9%；下層土置換后（SLRB）土壤真菌數量分別降低了37.1%、15.9%和23.3%?？梢?，土層置換不僅可以改變老齡蘋果園土壤原有的真菌分布，還可以顯著影響土壤真菌的生長。

圖1 土層置換對土壤真菌數量的影響

2.3.2 土層置換對老齡蘋果園土壤細菌的影響

由圖2可以看出，三地老齡蘋果園土壤凍融后，各土層細菌數量均顯著降低；上下土層經過原位回填（CKA/CKB）和土層置換（SLRA/SLRB）處理后，三地土壤細菌數量變化均表現出先增加后降低再增加的趨勢，5和9月土壤細菌數量達到峰值；土層置換后9月數據結果表明，上層土置換后（SLRA），蒙陰、萊州和棲霞三地土壤細菌數量均顯著增加，分別增加了38.1%、9.4%和17.9%；下層土置換后（SLRB），蒙陰、萊州和棲霞三地土壤細菌數量分別增加了31.3%、21.2%和40.1%。可見，原位回填處理在改變土壤細菌原有分布的同時，可以增加老齡蘋果園各土層土壤細菌的數量。

圖2 土層置換對土壤細菌數量的影響

2.3.3 土層置換對老齡蘋果園土壤放線菌的影響

由圖3可以看出，三地老齡蘋果園土壤凍融后，各土層放線菌數量均顯著降低；上下土層經過原位回填（CKA/CKB）和土層置換（SLRA/SLRB）處理后，三地土壤放線菌數量變化均表現出先趨于穩定后增加的趨勢，其中蒙陰和棲霞兩地變化差異較小；土層置換后9月數據結果表明，上層土置換后（SLRA），蒙陰、萊州和棲霞三地土壤放線菌菌數量均顯著降低，分別降低了38.0%、24.9%和51.9%；下層土置換后（SLRB），萊州和棲霞兩地土壤放線菌數量分別降低了26.9%和2.8%，而蒙陰增加了24.2%。

圖3 土層置換對土壤放線菌數量的影響

2.3.4 土層置換對老齡蘋果園土壤細菌/真菌的影響

由圖4可以看出，三地老齡蘋果園土壤凍融后，各土層土壤細菌/真菌值均顯著升高；上下土層經過原位回填（CKA/CKB）和土層置換（SLRA/SLRB）處理后，三地土壤細菌/真菌值均表現出先趨于穩定后增加的趨勢，土層置換后9月數據結果表明，上層土置換后（SLRA），蒙陰、萊州和棲霞三地土壤細菌/真菌值分別為1.45×103、1.35×103和2.94×103；下層土置換后（SLRB），蒙陰、萊州和棲霞三地土壤細菌/真菌值分別為1.94×103、2.03×103和2.87×103；而原位回填處理后，上層土原位回填后（CKA）土壤細菌/真菌值分別為0.76×103、1.05×103和2.02×103；下層原位回填后（CKB）土壤細菌/真菌值分別為0.93×103、1.61×103和1.80×103。可 見，土層置換處理后可以顯著增加三地果園各層土壤的細菌/真菌值，促使果園土壤向著高肥的細菌型轉變。

圖4 土層置換對土壤細菌/真菌的影響

2.4 土層置換對土壤中4種鐮孢菌的抑制效果

由表4可以看出，三地老齡蘋果園上層土壤4種鐮孢菌的基因拷貝數均顯著高于下層，經過土層置換后，三地上下層土壤4種鐮孢菌的基因拷貝數均有所降低，且表現出顯著性差異，其中以輪枝鐮孢菌的基因拷貝數降低最顯著，尖孢鐮孢菌次之。蒙陰上下層土壤尖孢鐮孢菌和輪枝鐮孢菌基因拷貝數分別降低了39.35%、40.93%和21.65%、46.56%。萊州上下層土壤尖孢鐮孢菌和輪枝鐮孢菌基因拷貝數分別降低了19.53%、5.11% 和40.95%、42.63%；棲霞上下層土壤尖孢鐮孢菌和輪枝鐮孢菌基因拷貝數分別降低了10.38%、25.86%和25.37%、26.58%?？梢?，土層置換處理對土壤中鐮孢菌有很好的抑制效果。

表4 土層置換對土壤鐮孢菌基因拷貝數的影響

2.5 土層置換對土壤陽離子交換量的影響

從圖5可以看出，三地老齡蘋果園土壤上下土層置換后，土壤的陽離子交換量變化不同；蒙陰、萊州和棲霞三地上層置換到下層后土壤陽離子交換量均顯著高于上層土壤原位回填處理，分別增加了4.0%、25.4%和42.6%；而下層土置換到上層后除棲霞土壤陽離子交換量增加外，蒙陰和萊州兩地土壤陽離子交換量分別降低了16.1%和10.1%。可見，土層置換對三地各土層土壤陽離子交換量的影響不同。

圖5 土層置換對土壤陽離子交換量的影響

2.6 土層置換對平邑甜茶幼苗葉片光合效率的影響

從圖6可以看出，蒙陰、萊州和棲霞三地老齡蘋果園土壤經過上下土層置換后，平邑甜茶幼苗的凈光合速率、蒸騰速率與胞間CO2濃度均顯著高于原位回填處理，其中凈光合速率分別增加了20.4%、16.1%和18.0%；蒸騰速率分別增加了11.9%、20.1%和22.5%；胞間CO2濃度分別增加了1.3%、4.8%和5.6%，差異均達顯著性水平；但氣孔導度變化差異不一致，蒙陰和萊州兩地分別顯著增加了17.7%和10.6%，而棲霞顯著降低了31.2%。

圖6 土層置換對平邑甜茶幼苗葉片光合效率的影響

3 討論

3.1 土層置換促進老齡蘋果園再植幼苗的生長

土壤是果樹所需水分和礦質營養的主要來源，良好的水、肥、氣、熱環境，可以促進果樹根系的生長［13，17］。朱寶國等［18］研究發現果樹的連年栽植和農藥的過量施用，會造成耕層土壤養分失衡，使原來有利于作物生長的“肥沃土層”變成不利于作物生長的“毒土層”。高中超等［19］研究發現，殘留農藥及除草劑主要集中分布在0～10 cm表層土壤，而將上下土層進行置換后，不但可以消除殘留農藥及除草劑對作物的毒害，還有利于不同土層土壤養分均勻分布，提高土壤通透性，改善土壤的物理性質，為作物生長提供良好的土壤環境，從而提高作物產量［20-23］。目前土層置換技術主要應用于解決農作物連作的問題，通過土層置換后，大豆重迎茬地塊增產16.8%，種植玉米增產2%，種植甜菜增產637.3%，種植馬鈴薯增產104.1%［24-26］，王洋等［27］研究發現凍融會影響土壤有機質含量，改善土壤理化性質。在本試驗中，三地老齡果園土壤經過土層置換后可以顯著促進平邑甜茶幼苗地上及地下部分的生長，可能是土層置換處理后改善了土壤環境，從而減輕了連作障礙對再植幼苗生長的影響。

3.2 土層置換降低土壤中致病菌數量并改善連作土壤微生物群落

細菌、放線菌和真菌是土壤微生物的三大主要類群，其種群數量、分布與活性等代表了土壤中養分循環和營養轉化的程度，同時也可以作為評價土壤質量和健康狀況的重要指標［28-30］。土壤微生物的種類、數量及活動能力主要受土壤溫度、水分［31］、營養狀況及土壤理化性質等的綜合影響［32］。李智衛等［33］研究發現，同種或同科作物在長期栽植條件下，土壤肥力變差，土壤細菌數量明顯減少，有害真菌數量明顯增加，影響植物的生長發育，且老齡蘋果園土壤微生物數量具有明顯的垂直分布規律，一些有害真菌主要集中在表層土壤，并隨著土壤深度的增加而減少［34-35］。Westcott［36］研究發現，放線菌也是導致再植病的主要因素。而土層置換技術可以改變原有土層結構，全面活化土壤養分，提高土壤酶活性，致使土壤微生物數目發生改變，增加土壤整體微生物活性［9，37-38］。在本試驗中，三地老齡蘋果園土壤凍融以后，各土層真菌、細菌和放線菌數量均顯著降低，這與宋陽等［39］在凍融作用上的研究結果一致；上下土層置換處理后，土壤真菌和細菌數量都表現出先降低后增加的趨勢，降低原因可能是機械作業對土壤結構及養分含量造成了一定的影響［21］；且上下土層置換后土壤真菌和放線菌數量均降低，有害鐮孢菌的基因拷貝數也顯著下降，細菌數量增加，土壤細菌/真菌值均顯著增加，使果園土壤微生物群落整體向著有益于果樹生長的方向發展。

3.3 土層置換影響土壤陽離子交換量

土壤膠體表面所能吸附的各種陽離子總量稱為土壤陽離子交換量［40］，其大小可以作為衡量土壤保水保肥能力的指標及農田土壤改良和合理施肥的重要依據［41］。土壤陽離子交換量主要與土壤質地、有機質含量及土壤pH等多種因素有關［20，42］；通過土壤陽離子交換量的變化，可以判斷土層置換對土壤保水保肥能力的影響。在本試驗中，三地老齡蘋果園土壤上下土層置換后，上層置換到下層后土壤陽離子交換量均顯著升高，可能與上層土置換到下層后土壤緩和了農藥殘留對土壤造成的危害有關，下層置換到上層后土壤陽離子交換量變化不同，除棲霞土壤陽離子交換量增加外，蒙陰和萊州兩地土壤陽離子交換量均顯著降低，降低的原因可能與土壤孔隙度及土壤粘粒含量變化有關［43-44］，但各地均值都低于20.0 cmol/kg，土壤肥力欠缺。張墨［45］研究發現，腐殖質等物質可以有效改善土壤陽離子交換量，因此可以在農田土壤中適當施加肥料，有效增強土壤的保肥保水能力，從而達到更好的防治效果。

3.4 土層置換影響平邑甜茶幼苗的光合作用

光合作用是植物利用光能，合成有機物并釋放氧氣的過程［46］，也是植物體干物質積累的主要來源，對植株的生長發育具有重要作用［47-48］。光合作用受到抑制后，會造成吸收的光能過剩，產生過量的活性氧和丙二醛等膜脂過氧化物，使植物體內活性氧代謝失衡，破壞生物膜結構，光合能力下降［49-50］。王才斌等［51］研究發現，花生連作2年后，單葉光合速率降低了3.3%，群體光合速率降低了5.4%，造成干物質積累減少，產量降低；且番茄、辣椒連作后也會導致光合葉片減小，植株整體光合物質積累降低，造成產量下降［52］。葉片的凈光合速率、蒸騰速率等光合參數是植物外部環境因子（比如CO2濃度、氣溫、光照強度、水分和養分供應等）和內部生理反應（如羧化酶活性、電子傳遞速率等）綜合作用的結果［53-57］，這些參數的變化直接反映了植物在光合生理上對環境條件的適應程度［58-59］。本試驗研究發現，蒙陰、萊州和棲霞三地老齡蘋果園土壤經過上下土層置換后，平邑甜茶幼苗的凈光合速率、蒸騰速率與胞間CO2濃度均顯著高于原位回填處理，植株光合能力增強，提高了對環境的適應能力；蒙陰和萊州兩地氣孔導度也明顯增加，但棲霞降低了31.2%，分析可能與當地干旱、溫度過高及內部生理反應等有關［60］。

4 結論

老齡蘋果園在土層置換后，可以顯著促進平邑甜茶幼苗的生長和植株葉片的光合作用；降低土壤真菌數量，增加土壤細菌數量和土壤細菌/真菌值，同時降低了土壤中4種有害鐮孢菌的基因拷貝數，優化了土壤微生物群落結構，說明土層置換可以有效緩解老齡蘋果園連作障礙。