一株水稻內生菌久留里副伯克霍爾德（Paraburkholderia kururiensis）的分離鑒定及促生功能的評價

王 星，孟炯放，馬 榮，何山文，2，郭鶴寶，張曉霞*

（1.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081；2.上海市園林科學規劃研究院，上海 200232）

“Endophyte”一詞釋義為內生菌，最早是由德國科學家DeBarry在1886年提出的［1］。植物內生菌可以在宿主體內定居，并與宿主長期共同進化，是一類宿主廣泛、種類豐富以及生物學功能多樣的微生物［2］。截至目前，在小麥、甘蔗和玉米植物等［3-5］植物的不同部位（根、莖、葉、花、果、種子）中［6-7］均發現了內生菌。根據之前的研究，水稻中也分離出了大量的內生菌，有些內生菌在一定程度上還對植物的生長有利［8］，比如，通過固氮［9］、產生植物生長素（IAA）［10］、合成鐵載體及抑制病蟲害發生等方式促進植物生長［11-12］。許多內生菌也具有可以阻止病原微生物侵染作物的能力［13］。 Fujita等［14］從水稻中分離的一株促生菌Azospirillumsp. B510，通過在番茄根系組織中建立內生定殖后，發現其對由丁香假單胞菌（Pseudomonas syringaepv.tomato）引起的細菌性葉斑病具有抗性。內生菌具有溶解土壤中磷的功能，首先將土壤中難以轉化利用的磷分解為可以溶解的磷［15-16］，最終實現有效磷的利用［17-18］；有些細菌體內還含有1-氨基環丙烷羧酸（ACC）脫氨酶活性，通過控制植物體內的乙烯濃度來調控植物的生長［19］；微生物可以誘導合成鐵載體，該類物質通過吸收利用環境中的鐵，從而作用到自身以及植物身上，當與病原菌競爭有限的鐵營養時會抑制病原菌的生長繁殖，從而達到生物防治的作用［20］；長期使用化肥已經導致污染環境和危害人類的健康，而利用植物內生菌或次生代謝產物來預防或治療上述相關的諸多問題是有很多益處的：綠色菌肥不僅不會對作物產生危害，還能在一定程度上抑制病原菌的生長，從而適當提高了植物的抗病力和產量。

本研究從水稻根中分離到一株內生細菌，通過16S rRNA基因初步鑒定為久留里副伯克霍爾德菌（Paraburkholderiakururiensis）；通過研究發現其對水稻幼苗有顯著促生功能，為水稻專用的微生物肥料提供了優良的菌株資源。

1 材料與方法

1.1 菌株

Paraburkholderia kururiensisHMC50是從稻-稻-黑麥草輪作的水稻根中分離出來的，用于測固氮酶活性的對照菌株為圓褐固氮菌（Azotobacter chroococcumACCC10006），來源于中國農業科學院農業微生物菌種保藏中心。HMC50在TSA培養基中培養，ACCC10006在阿須貝氏培養基［21］中培養，培養溫度為30 ℃。

1.2 實驗試劑配制

1.2.1 培養基配制

本實驗使用的培養基為TSA培養基（Difco）［22］、PKO無機磷培養基［23］、DF培養基和ADF培養基［24］、IAA檢測培養基［25］、CAS藍色定性檢測固體培養基［26］、改良的Dobereiner蔗糖蘋果酸半固體無氮培養基［27］。血平板購買自北京大宏生物有限公司；LB培養基：蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母粉5 g、去離子水1 L。

1.2.2 溶液配制

Salkowski比色液：1 mL 0.5 mol/L FeCl3，50 mL 35% HClO4。考馬斯亮藍：100 mg G-250溶入50mL的95%乙醇中，加入100 mL的95%磷酸，去離子水定容到1 L。PBS緩沖液：KCl 0.2 g、NaCl 8 g、KH2PO40.24 g、Na2HPO43.58 g，并用去離子水定容到1 L。CAS檢測液：見文獻［21］。

1.3 HMC50菌株分子生物學鑒定

利用細菌基因組試劑盒（天根，中國北京）提取菌株HMC50的基因DNA，采用通用引物27F（5’-GTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT -3’）測 定16S rRNA基因序列。PCR反應體系（25μL）：3 μL模板DNA，1 μL primers（F/R），2 μL dNTPs，2.5 μL 10×Taq Buffer，0.25 μL Ex taq，16.25 μL ddH2O。PCR 擴增條件為：94℃ 5 min，94℃ 30s，55℃ 1 min，72℃ 90 s，30個 循 環；72℃ 10 min。獲得PCR產物后，送測至生工生物工程（上海）股份有限公司。利用NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）網站進行序列比對，與菌株HMC50親緣關系相近的菌株自EZBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）網站下載，利用MEGA 7.0和鄰接法（Neighbor-Joining）［28］構建系統發育樹，初步確定親緣關系。

1.4 HMC50 菌株基因組測序與分析

提取菌株HMC50的基因組DNA，送至安諾優達基因科技（北京）有限公司測序。采用SPAdes 2.9.0［29］對去除接頭序列的測序數據進行從頭拼接，使用27至127（27、47、63、77、89、99、107、115、121和127）范圍內的多個k-mer組合進行組裝，其中k-mers 127組裝效果最佳。使用TYPE（STRAIN）GENOME SERVER（TYGS）網站［30］對該菌株進行基因組水平的鑒定，其中包括DDH（DNA hybridization）值的計算以及使用GBDP（genome blast distance phylogeny）和鄰接法構建全基因組樹。進一步利用RAST［31］在線網站（https：//rast.nmpdr.org/）進行基因注釋，并使用antisMASH 3.0［32］在線工具預測與次級代謝產物相關的基因簇，將所得的16S rRNA序列和基因組序列上傳提交至NCBI獲得登錄號。

1.5 HMC50菌株功能特性實驗的檢測

1.5.1 溶磷實驗［33］

將待測菌株分別點接于PKO無機磷培養基上，并于28℃進行培養，設置3個重復，每隔24 h測量一次溶磷透明圈直徑（HD）和菌落直徑（CD），計算比值（比值為1的菌株無溶磷能力），至比值無變化為止，確定測定菌株溶磷效果。

1.5.2 產IAA實驗［34］

實驗中選用Salkowski比色法［35］測量植物內生細菌分泌植物生長素（IAA）。定性檢測：通過顏色深淺反映產生IAA的多少；定量檢測：標準曲線的繪制采用分析純，將菌懸液離心后的上清液和Salkowski比色液等體積混合后，室溫避光靜置30min，測定其OD530值，并測量相應菌懸液OD600的值，定量結果計算出的數值越大，表明分泌IAA的量越大。

1.5.3 產鐵載體實驗［21］

具有產鐵能力的細菌微生物可以在備置好的產鐵載體定性平板上形成一圈橘黃色的暈圈。定性檢測：觀察目的菌株在CAS藍色定性檢測平板上的生長情況；定量檢測：CAS檢測液與菌懸上清液等比混合，靜置l h后采用分光光度計測定630 nm波長處的吸光值（A），取培養基（TSB）作為對照調零。CAS檢測液與TSB培養基等比混合，測定吸光值即為參比值（Ar），并測量A/Ar值。

1.5.4 ACC脫氨酶活性測定［36］

首先將HMC50菌懸液接種于DF培養基中，180 r/min 30℃培養24 h，之后將DF菌懸液轉接兩次于ADF培養基中，180 r/min 30℃培養48 h。利用酶標儀測定菌濃度OD600，以不接菌的ADF液體培養基為陰性對照，測得的差值即為實際菌液濃度值，值大于0.1表明菌株能夠利用ACC作為唯一氮源生長，初篩后收集菌體，制備粗酶液，繪制α-酮丁酸標準曲線，測定200μL粗酶液中的總蛋白和ACC脫氨酶活性。按照式（1）計算ACC脫氨酶活性（U/mg）。

1.5.5 固氮基因（nifH基因）的擴增

上述已用試劑法提取了菌株HMC50的基因組DNA，用nifH基因引物IGK3和DVV（IGK3 5’-GCI WTHTAYGGIAARGGIGGIATHGGIAA-3’；DVV 3’-CT RCAICAIACRCCICCIAARCGITA-5’）進行PCR擴增。PCR反應體系（25 μL）：3 μL 模板 DNA，0.5 μL IKG3（10 μmol/L），0.5 μL DVV（10 μmol/L），2 μL dNTPs，2.5 μL 10×Taq Buffer，0.25 μL Ex taq，16.25 μL ddH2O。PCR 擴增條件為：94℃ 2 min，94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，40個循環；72℃3 min。取2 μL PCR產物進行電泳檢測（1%瓊脂糖凝膠），110 V，300 mA，35 min，反 應 結 束 后Ethidium Bromide浸 泡10 min觀 察條帶。

1.5.6 固氮酶活性測定［21］

常用的測定固氮酶活性的方法之一是乙炔還原法，通過氣相色譜法檢測乙炔是否被還原成乙烯以及數量多少，從而間接測定是否有固氮酶活性及其酶活性的高低，對照菌株選擇ACCC10006。先做1 mol C2H4氣體的標定，之后用固體法測乙烯的量。按照式（2）計算固氮酶活性

式中：C2H4（nmol）=普析氣相檢測濃度×V試管×10。

1.6 HMC50菌株促生盆栽試驗的驗證

1.6.1 盆栽試驗材料

已純化的HMC50菌株接種于LB培養基中，30℃、轉速220 r/min、48 h進行培養；水稻品種選用日本晴；土壤采用菜園土與蛭石3∶1混勻后裝盆；試驗用盆購買自花卉市場，尺寸為上直徑15 cm、下直徑10 cm、高12 cm。

1.6.2 盆栽試驗方法

制備108CFU/mL的菌懸液，水稻種子解除休眠，并催芽，采用灌根方式接種，經過播種、定苗、田間管理培養30 d后，測量植株的單株重（g）、總干重（g）、總鮮重（g）、根重（g）、莖重（g）、莖長（cm）和根長（cm）指標，并將所得數據利用SPSS 20.0進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 HMC50 菌株的鑒定

對已純化的菌株HMC50進行16S rRNA基因擴增，序列長度為1500 bp左右。將序列在NCBI和EZBioCloud網站中進行BLAST比對，通過分析發現其與Paraburkholderia kururiensissubsp.kururiensisTJCM10599（BAMQ01000301）的16S rRNA 同源性達到100%。使用Neighbor-Joining法構建系統發育樹（圖1）顯示：HMC50與P. kururiensissubsp.kururiensisTJCM10599處于同一個分支，HMC50的16S rRNA序列已經上傳GenBank，獲得登錄號MW276133。

圖1 基于16S rRNA基因序列使用鄰接法構建系統發育樹

2.2 HMC50菌株的基因組概述及特征

對菌株HMC50進行基因組草圖測序，并提交GenBank，序列號為 JADCKR000000000。HMC50基因組全長7350161 bp，由171個contigs組成，G+C含量為64.9%。根據TYGS網站默認參數確定最接近的基因組序列，共包含15株參考菌株以及一個外群菌株Trinickia symbioticaJPY345T，同時構建了基于全基因組的系統發育樹（圖2），發現該菌株與Paraburkholderia kururiensisLMG19447T聚類到一起，并且兩株菌的DDH值為83.6%，70%為原核生物分類閾值［37］，基于16S rRNA基因及全基因組數據確定菌株HMC50為Paraburkholderia kururiensis，參考菌株的基因組信息和登錄號見表1。該基因組共編碼7023個基因，其中2180個（35%）是假設蛋白。另外，編碼rRNA基因3個、tRNA 21個、ncRNA 32個。表2列出了菌株HMC50可能具有的有益特征，比如與促進植物生長、解毒、運動性等相關的主要特征。通過注釋結果發現與固氮相關的基因共有18個，包括固氮酶鐵蛋白、固氮酶鉬鐵蛋白α鏈（EC 1.18.6.1）和固氮酶鉬鐵蛋白β鏈（EC 1.18.6.1）基因。NifBE基因負責鐵鉬輔因子（FeMo-co）的生物合成，NifOZT基因與固氮酶復合物的生物合成有關，同時發現該菌株攜帶有固氮酶鐵蛋白nifH關鍵基因。因此，從基因水平上預測菌株HMC50具有固定N2的能力；菌株HMC50攜帶的基因可能能夠抵抗植物組織中存在的有毒化合物，包括過氧化氫酶、谷胱甘肽S轉移酶、硝化酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶以及能夠攝取硒酸鹽和亞硒酸鹽；該菌株的基因組還預測到59個趨化性和運動性的基因，注釋到的基因全都是由鞭毛運動介導的，同時鞭毛的運動性能夠促進細菌與宿主的相互作用；色氨酸是植物生長素吲哚乙酸（IAA）的合成前體，IAA在促進植物生長方面具有調節作用［38-39］，在合成生長素的子系統中，發現色氨酸合酶α鏈（EC 4.2.1.20）和色氨酸合酶β鏈（EC 4.2.1.20）初步在基因水平預測該菌株能產IAA。基因組還包含一些與Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ型分泌系統相關的基因；利用antiSMASH 3.0對基因組進行次生代謝產物的預測，共發現6種次生代謝基因簇（表3）。其中2個屬于非核糖體肽合成酶基因簇（Nonribosomal peptide-synthetase，NRPS），分別編碼脂肽和半乳糖素，此外還編碼萜烯、芳基多烯、芥酸內酯和異胞糖脂合酶類蛋白激酶。

表2 菌株HMC50基因組中與促進植物生長和生物防治相關的基因列表

表3 菌株HMC50基因組預測的次生代謝產物生物合成基因簇列表

圖2 基于基因組使用鄰接法構建系統發育樹

表1 菌株HMC50和參考菌株的基因組以及登錄號信息

2.3 HMC50菌株的功能特性

2.3.1 分泌IAA性能定量檢測

色氨酸是植物生長素IAA的合成前體［34］，在培養基中加入色氨酸可誘導微生物合成IAA，在過氯酸存在的條件下，IAA可以與氯化鐵發生顯色反應，進而來判斷IAA的生成量。定性測量結果：菌株HMC50在白色陶瓷板上顏色變淺紅，表示能夠分泌IAA。分泌IAA定量檢測結果為29.57 mg/L，IAA定量的標準曲線見圖3，分泌IAA的能力定性檢測結果和定量檢測數據見表4。

圖3 IAA標準曲線

表4 菌株分泌IAA能力定性檢測結果和定量檢測數據

2.3.2 固氮基因擴增結果以及固氮酶活性能力

基因組預測結果中發現了nifH基因，nifH基因是編碼固氮酶的結構基因，也是許多固氮微生物的主要固氮基因之一［40］，所以對HMC50菌株進行nifH基因擴增的驗證實驗，擴增片段長度在340bp左右。圖4為nifH基因擴增圖，陽性對照圓褐固氮菌ACCC10006為中國農業微生物菌種保藏中心的一株固氮酶活性很強的菌株。進一步利用氣相色譜法準確地測定了菌株將乙炔還原成乙烯的量，進而計算出固氮酶活性為11.9 nmol/（mL·h），測得圓褐固氮菌ACCC10006的酶活性為14.5 nmol/（mL·h），說明菌株MHC50具有較高的固氮酶活性，結果見圖5。

圖4 nifH基因PCR擴增圖

圖5 菌株HMC50固氮酶活性

2.3.3 產鐵載體能力

鐵載體檢測通常采用定性初篩及A/Ar值的相對定量實驗，認為A/Ar為0～0.6時產鐵載體能力較強（+++）、0.6～0.8為中等（++）、0.8～1.0為較弱（+）。經過定量和定性檢測結果發現HMC50菌株的產鐵載體能力較強，結果見表5。

表5 供試菌株HMC50產鐵載體能力的定性結果和定量檢測數值

2.3.4 ACC脫氨酶活性

利用酶標儀測定菌濃度OD600的平均值為0.35，實際菌液濃度OD600大于0.1以上，初步表明該菌株能夠利用ACC作為唯一氮源生長。之后收集菌體凈重是0.26 g，α-酮丁酸的物質的量為2.3775 μmol，粗酶液中總蛋白量為0.2264 mg，HMC50的ACC脫氨酶活性是1.34 U/mg。

2.3.5 溶解無機磷能力

點接法培養一周左右，觀察計算菌落溶磷透明圈直徑（HD）與菌落直徑（CD）的比值是3.97，菌株HMC50具有溶解無機磷能力，圖6為菌株HMC50的溶解無機磷情況。

圖6 菌株HMC50溶解無機磷能力

2.4 HMC50菌株的促生效果

基于功能特性試驗發現菌株HMC50具有產鐵載體、分泌IAA、產ACC脫氨酶、提高固氮酶活性、溶解無機磷的功能，進一步設計了盆栽試驗探究菌株對水稻生長的促生作用（圖7），在育苗1個月后收集并整理所測量的各參數數值，結果顯示接種菌株HMC50后，根長、莖長、總鮮重、總干重、莖重 、根重以及單株重等指標相比對照組（CK）都表現出了明顯的優勢（表6），各水稻性狀及相比于CK的方差分析結果見表6。

圖7 接種菌株HMC50對水稻生長的影響

表6 水稻性狀方差統計

3 討論

Sawana等［41］在2014年基于分子標記和系統生物學的分析，提議將原伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）分為兩個屬，一類主要為包含人與植物病原微生物的伯克霍爾德菌屬（Burkholderia），另一類為不同環境中的微生物，并重新命名為副伯克霍爾德菌屬（Paraburkholderia），其中包括P. kururiensis。已有研究顯示，伯克霍爾德菌和副伯克霍爾德菌在自然環境中分布廣泛，從香蕉、菠蘿、甘蔗、煙草和木薯中均發現了這一類群的菌［42-43］，且具有生物降解能力［44-45］，產生的化合物具有抗菌活性［46］，還能夠促進植物生長［47］，是公認的內生固氮菌［48］。但是對P. kururiensis菌株進行全面系統的功能特性的研究報道較少，本研究對從水稻根中分離到的P.kururiensisHMC50，在基因組水平上預測到其具有固定N2以及分泌IAA的促生潛能，并且發現59個基因與鞭毛的運動性相關，推測這能促進微生物與宿主的相互作用，有利于定殖的發生，產生的化合物具有解毒作用，攜帶多個參與生物降解能力的相關基因。也有學者初步探究了P. kururiensis的基因組數據［49］，本研究不僅在分子水平上進行基因預測分析，也結合了功能評價的驗證實驗，對該菌株進行了固氮酶活性的測定，結果發現其固氮酶活性達到了11.9 nmol/（mL·h），與具有高固氮酶活性的圓褐固氮菌ACCC10006的酶活性相近。同時也發現此菌株的確具有分泌IAA的能力，IAA是一種植物體內普遍存在的內源生長素，通過不同的信號傳導途徑激發各種生理效應，促進植物的生長發育［50-52］。除此之外還具有產鐵載體、產ACC脫氨酶、溶磷的功能；在盆栽試驗中，測量HMC50實驗組的各性狀指標都優于空白對照，初步認為其具備優良的促生能力，進一步的研究將轉入田間自然的生態環境中，驗證并挖掘菌株HMC50對植物的有益作用，觀察水稻的促生效果能否與室內培養效果達到一致。

4 結論

本研究從水稻根中分離到一株內生細菌HMC50，鑒定為久留里副伯克霍爾德菌（Paraburkholderia kururiensis），通過基因組預測和功能特性實驗的驗證，發現其具有產鐵載體、分泌IAA、產ACC脫氨酶、固氮、溶解無機磷的功能，可以顯著促進水稻幼苗的生長，為水稻特用的微生物肥料研究方面提供了優良的菌株資源。