PCL-b-PNIPAM配位Eu（Ⅲ）構筑的超小尺寸稀土配合物熒光納米探針用于腫瘤細胞雙色成像

關曉琳 丁媛媛 來守軍 楊學琴 韋鏡玉張家銘 張麗媛 童金輝 雷自強

(1西北師范大學化學化工學院，生態功能高分子材料教育部重點實驗室，甘肅省高分子材料重點實驗室，蘭州 730070)

(2蘭州文理學院化工學院，蘭州 730000)

0 引 言

熒光生物成像技術因其出色的時空分辨率、高靈敏度、多通道成像等優勢，在生物成像和臨床診療等領域前景巨大[1-3]，其中具有高量子產率、超高光穩定性和優異的生物兼容性的各類熒光探針是熒光生物成像技術發展的關鍵。在眾多的熒光探針中，稀土熒光配合物以其特殊的多孔腔和顯著的發光特性被廣泛應用于催化、傳感器、生物成像和光學材料等領域[4-8]。稀土配合物的熒光來源于鑭系離子的發光，可以起源于構型內4f-4f躍遷、構型間4fn→4fn5d1躍遷和電荷轉移躍遷(ligand-to-metal charge transition 和 metal-to-ligand charge transfer)。這賦予了鑭系元素獨特的發光性能，適合于生物成像。稀土配合物的熒光有著與環境無關的元素特征發射、抗光漂白、熒光壽命長等優點，這有助于提高信噪比，使成像效果更好。在眾多稀土配合物中，Eu（Ⅲ）配合物具有純紅熒光、壽命長、單色性好等優點。四川大學林云峰等以Eu/Ba共摻雜和F取代的透明質酸為模板制備的納米粒子(HA@NFAP∶Eu/Ba)，具有更高的摻雜效率、優異的單分散性和穩定性，并且HA@NFAP∶Eu/Ba在體內外均有腫瘤靶向性，且無明顯毒副作用[9]。Sava Gallis等設計了一種基于稀土金屬簇合物(Eu、Nd、Yb、Y、Tb)的新型材料，與細胞共培養后證明了其作為生物顯像劑的可行性[10]。盡管已有文獻報道了Eu配合物作為生物成像劑的優勢，然而，仍有一些不足之處需要改善，例如熱穩定性差、發光強度低、電子轉移效率低等。

近年來，另一類基于聚合物的新型有機熒光納米粒子——聚合物量子點(polymer dots，Pdots)，漸漸引起研究者的關注。與傳統的光學材料相比，Pdots具有熒光亮度高、光學穩定性好、納米尺寸可調、生物毒性低等優點，在生物成像、傳感檢測、藥物傳遞和治療診斷等方面具有巨大的應用潛力[11-16]。然而，已報道的眾多Pdots熒光探針[17-20]的組成中大部分含有大共軛結構，這將引發嚴重的聚集熒光猝滅現象(aggregation-caused quenching，ACQ)，極大限制了高濃度或聚集態下半導體Pdots在生物方面的實際應用。為了解決這一問題，近幾年，研究者通過共價鍵合的方式直接將具有聚集誘導發光(aggregation-induced emission，AIE)特性的熒光小分子鍵合于兩親性聚合物上，再自組裝得到Pdots，通過該方法可以獲得穩定的納米粒子。目前，吉林大學的田文晶教授課題組和清華大學危巖教授課題組在利用共價鍵合方式制備AIE型非半導體Pdots方面均開展了多年研究工作，并取得了系列進展[21]。例如，田文晶教授課題組制備了一種基于AIE小分子9，10-二苯乙烯基蒽(DSA)的高熒光量子產率的Pdots，并將葉酸修飾在量子點的表面，成功實現了靶細胞成像[22]。危巖教授課題組則通過采用一種可控/活性自由基聚合方法(可逆加成-斷裂鏈轉移聚合，RAFT)制備了一種具有AIE性能的Pdots，該類熒光探針表現出優異的耐光漂白性能和生物相容性等優點，在細胞熒光成像等方面具有很大的潛力[23-24]。但是，目前熒光Pdots多為單發射短波長的熒光探針，在實際應用過程中容易受到復雜環境和激發波長等多種因素干擾。尤其是在生命科學應用中，短波長單發射熒光探針將對生物組織造成一定的光損傷，同時還會受到生物樣品自發藍色熒光的干擾，影響測試或成像效果，從而極大地限制了其在活體生物成像方面的應用[25]。相比之下，具有雙熒光發射功能的Pdots則具有許多優勢，例如強抗干擾能力、高分辨率、優異光學穩定性及測試重現性等，從而有效避免單熒光發射探針存在的缺陷，其中具有紅光發射的Pdots更有利于深層組織的活體光學成像。因此，設計、合成具有紅光發射的雙熒光Pdots對生物熒光成像具有非常重要的應用價值。

因此，我們認為，將Pdots與發紅光的Eu（Ⅲ）配合物相結合，不僅可以解決稀土離子本身發光強度較弱的缺點，同時可以提高傳統Pdots的成像效果，使得基于Pdots的Eu（Ⅲ）稀土配合物熒光探針在臨床成像方面具有很大的應用前景。但是，目前國內外有關通過共價鍵合方式制備含稀土元素的Pdots以及在生物成像方面的應用報道仍然很少[26-28]。

近幾年，本課題組通過在AIE熒光小分子上原位引發聚合然后與稀土離子Eu（Ⅲ）發生配位最后自組裝的方法，合成出多種具有雙熒光發射的非半導體型Pdots。這些Pdots具有較低的細胞毒性，通過調節激發波長，對腫瘤細胞展現出了優異的藍/紅雙色熒光成像能力和可逆雙色熒光切換功能[27-28]。但是，由上述方法合成的Pdots具有粒徑不可調，尺寸較大的缺陷。因此，在本研究中，我們采用開環和自由基聚合技術，先后將疏水性聚己內酯(PCL)和親水性聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)共價偶聯于四苯乙烯(TPE)小分子上，再與Eu（Ⅲ）發生配位，分別制備出含有單臂、雙臂和四臂的雙親性嵌段共聚物-Eu（Ⅲ）配合物1s-TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu（Ⅲ）、2s-TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu（Ⅲ）和4s-TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu（Ⅲ）(簡稱為TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4)，最后自組裝形成具有雙熒光發射的小尺寸Pdots。系統研究Eu（Ⅲ）配位量與Pdots尺寸、雙熒光性能、溫敏性及細胞成像性能的關系，為設計、合成含Eu（Ⅲ）配合物的小尺寸Pdots材料提供有效制備方法，并為雙色Eu配合物Pdots材料在可逆雙色腫瘤細胞成像的生物應用方面提供理論支持。

1 實驗部分

試劑及表征分析儀器信息詳見Supporting information。此外，由于TPPE-1、TPPE-2、TPPE-4合成路線相似，為了避免重復，正文中僅給出TPPE-1的合成過程，TPPE-2和TPPE-4的合成過程詳見Supporting information。

1.1 引發劑羥基四苯乙烯(TPE-OH)的合成

將 4-羥基二苯甲酮(19.8 g，0.1 mol)、二苯甲酮(18.2 g，0.1 mol)和Zn粉(13.0 g，0.2 mol)加入500 mL三頸燒瓶中，再加入300.0 mL無水四氫呋喃使固體溶解，在氮氣保護和冰浴條件下，緩慢滴加四氯化鈦(51.2 g，0.27 mol)，攪拌30 min后緩慢升溫至回流溫度并過夜。加入150.0 mL 10%K2CO3水溶液猝滅反應，先過濾再用乙酸乙酯萃取，濃縮后通過柱層析分離提純(洗脫劑：V石油醚∶V乙酸乙酯=10∶1)得目標產物。產率 43%。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ7.15～6.98(m，15H)，6.87(d，2H)，6.52(d，2H)，4.61(s，1H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ153.96，144.28～143.62，140.29,136.37,132.71,131.52～131.16,127.63，126.24，114.57。

1.2 1s-TPE-PCL-OH的合成

將ε-己內酯(ε-CL，3.92 g，34.4 mmol)和TPE-OH(0.98 g，2.86 mmol)加入 100 mL 三頸燒瓶，再加入10.0 mL無水四氫呋喃，在氮氣保護下，在130℃下攪拌至溶液混合均勻。加入辛酸亞錫(Sn(Oct)2，0.058 g，0.143 mmol)后反應24 h。反應結束后，用冰水猝滅反應并用冰甲醇沉淀。最終產物真空干燥，產率 97%。1H NMR(600 MHz，CDCl3)：δ7.13～6.94(m，aromatic backbone)，6.84(d，aromatic backbone)，4.04(t，—CH2—CH2—OH)，2.28(t，O=C—CH2—CH2—),1.62(d,—CH2—CH2—CH2—)，1.36(t，—CH2—CH2—CH2—)，1.23(s，—CH2—CH2—CH2—)。

1.3 大分子引發劑1s-TPE-PCL-AZO的合成

將1s-TPE-PCL-OH(0.002 mol)、偶氮二氰基戊酸(ACVA，0.002 mol)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.006 mol)和100.0 mL無水四氫呋喃加入圓底燒瓶中，氮氣保護下加入二環己基碳二亞胺(DCC，0.002 mol)，然后升溫至回流溫度后過夜。反應結束后過濾濃縮，用乙醚沉淀離心。真空干燥得到白色粉末。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.14～7.16(s，aromatic backbone)，7.05～6.80(q，aromatic backbone)，3.95(t，O=C—CH2—CH2—)，2.24(t，O=C—CH2—CH2—)，1.51(d，—CH2—CH—C—)，1.27(p，—CH2—CH2—CH2—)。

1.4 單臂共聚物1s-TPE-PCL-b-PNIPAM(TPP-1)的合成

將1s-TPE-PCL-AZO(0.1 mmol)和N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM，10 mmol)加入100 mL三頸燒瓶中，再加入60.0 mL的無水四氫呋喃，氮氣氣氛下升溫至回流溫度反應過夜。反應結束后，在正己烷中沉淀并離心，真空干燥后得目標產物。1H NMR(600 MHz，D2O)：δ7.89(s，—NH—C=O)，7.61(d，aromatic backbone)，4.64(s，O=C-CH2—CH2—)，3.91～3.81(q，NH—CH—CH3)，3.81～3.74(d，O=C—CH—CH2—)，1.99(t，O=C—CH2—CH2—)，1.58(t，—C—CH2—CH—)，1.32(t，—C—CH3)，1.02(q，—CH—CH3)。

1.5 TPPE-1的制備

將40.0 mL濃鹽酸逐滴加入Eu2O3(7.02 g，0.002 mol)中，再加入氯化銨粉末后煮沸，真空干燥得EuCl3。用40.0 mL無水乙醇溶解TPP-1(50 mg)，再加入EuCl3(100 mg)，常溫充分攪拌過夜，用正己烷沉淀并離心后得到目標產物。

1.6 單、雙、四臂Pdots的制備

通過納米沉淀法來制備單、雙、四臂Pdots。用無水四氫呋喃溶解TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4，制備濃度為2 mg·mL-1的溶液作為原液。將原液稀釋至100 μg·mL-1，在超聲作用下取10.0 mL注入到裝有20.0 mL超純水的50.0 mL比色管中。繼續超聲5 min，隨后將比色管常溫攪拌24 h，去除有機溶劑后用過濾頭過濾得到單、雙、四臂Pdots。所得Pdots非常穩定，在常溫下保存數月后仍保持澄清透明，并且沒有聚集現象發生。

1.7 細胞毒性檢測

分別以人宮頸癌細胞系HeLa、人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞系A549為細胞模型，采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots的細胞毒性。將HeLa、HepG2、A549細胞接種在96孔板內，每孔200.0 μL，而96孔板的邊緣部分吸取磷酸緩沖鹽溶液(PBS)進行填充，隨后搖晃孔板并置入37℃、CO2體積分數5%的培養箱中孵育24 h。孵育結束后棄去原始培養基，將實驗分成6組，其中第1個對照組每孔加入180.0 μL的含氨基酸和葡萄糖的培養基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，剩余的實驗組分別加入3種Pdots(40、80、120、160、200 μg·mL-1)及每孔180.0 μL的培養基后進行MTT實驗。加樣結束后搖晃孔板并置于37℃、5%CO2培養箱中再孵育24 h。隨后每孔再加入20.0 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，放入培養箱中繼續孵育4 h后將液體吸出，并向每孔中加入150.0 μL二甲基亞砜使反應終止，搖晃孔板至結晶物質溶解即可。用酶標儀在490 nm處測定每孔的光密度(OD)值，進行3次平行實驗。用以下公式計算細胞存活率(RCS)：RCS=ODr/ODc×100%(ODr為實驗孔測定的吸光度，ODc為對照組測定的吸光度)。

1.8 細胞成像實驗

選取生長較好的HeLa、HepG2、A549細胞進行消化離心后，用顯微鏡在計數板上計數，隨后接種于12孔板，并加入含有12%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液，搖晃后放入37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后向每孔打入200 μg·mL-1的3種Pdots，再孵育24 h。最后用PBS洗滌取出的細胞爬片并進行最后的成像觀察實驗。細胞的觀察和細胞的拍攝均在蔡司Axio Scope.A1正置熒光顯微鏡下完成。

2 結果與討論

2.1 雙熒光發射的兩親性嵌段共聚物和Pdots的設計與合成

兩親性嵌段共聚物易于在溶液中通過自組裝形成具有形貌和尺寸可控的納米結構，因此常被用作功能化的自組裝材料。本研究依次采用開環聚合(ROP)和自由基聚合方法，分別在AIE熒光分子TPE的不同苯環位置上共價鍵合嵌段共聚物PCL-b-PNIPAM，分別得到含有單臂、雙臂和四臂結構的兩親性聚合物。接著，通過Eu（Ⅲ）與側鏈富含N、O原子的親水片段PNIPAM發生配位，合成具有紅光發射的兩親性稀土配合物。最后通過在水溶液中自組裝構筑出藍-紅雙熒光發射的小尺寸Pdots。3種兩親性共聚物的合成路線及Pdots組裝示意圖如圖1所示。

圖1 TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4 Pdots的制備、自組裝過程及細胞作用示意圖Fig.1 Preparation,self-assembly and acting on cells of TPPE-1,TPPE-2,and TPPE-4 Pdots

首先參考文獻[29]，分別合成單、雙和四羥基四苯乙烯(TPE-OH、TPE-2OH、TPE-4OH)，然后以其作為引發劑，引發單體ε-CL開環聚合，合成以TPE為中心的單、雙和四臂的疏水性聚合物1s-TPE-PCL-OH、2s-TPE-PCL-OH和4s-TPE-PCL-OH。然后利用聚合物末端羥基(—OH)與ACVA上的羧酸(—COOH)發生DCC酯化反應，合成3種大分子偶氮引發劑1s-TPE-PCL-AZO、2s-TPE-PCL-AZO和4s-TPE-PCLAZO，隨后原位引發具有溫敏性質的乙烯基單體NIPAM聚合，制得單臂、雙臂和四臂型兩親性嵌段共聚物：TPP-1、TPP-2和TPP-4。上述所得中間體和聚合物均通過1H NMR(圖 S1～S12)、13C NMR(圖S13～S15)、IR(圖S16～S21)和GPC(表 S1)等進行表征，確定了結構與分子量。最后，通過稀土元素Eu和嵌段共聚物側鏈片段PNIPAM發生配位，合成嵌段共聚物-Eu（Ⅲ）配合物：TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4，并通過自組裝形成了小尺寸Pdots。通過IR、光電子能譜(XPS)、透射電子顯微鏡(TEM，100 kV)、掃描電鏡-X射線能譜分析(SEM-EDX，5 kV)等測試確定共聚物-Eu（Ⅲ）配合物及Pdots的結構與微觀形貌。

2.2 單、雙、四臂兩親性嵌段共聚物-Eu（Ⅲ）配合物的結構表征

圖S22為兩親性嵌段共聚物配位前后的IR譜圖。由圖可知，聚合物TPP-1、TPP-2和TPP-4中仲酰胺的N—H特征吸收峰分別位于3 439、3 437和3 498 cm-1處，而在與Eu（Ⅲ）發生配位后，該特征吸收峰分別位移至3 349、3 265和3 350 cm-1，均發生明顯紅移，且峰形變寬。此外，與Eu（Ⅲ）發生配位后，TPP-1、TPP-2、TPP-4聚合物中分別位于1 649、1 654和1 652 cm-1的酰胺Ⅰ帶νC=O(主要是酰胺C=O伸縮振動)的特征吸收峰，均紅移至TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4中的1 622、1 618和1 629 cm-1，分別紅移了27、36和 23 cm-1。同時，位于1 543、1 544和1 549 cm-1的酰胺Ⅱ帶的特征吸收峰也分別移至1 562、1 551和1 544 cm-1。上述酰胺鍵特征吸收峰的峰形變化和紅移結果表明，Eu3+與TPE-PCL-b-PNIPAM側鏈的氮原子和羰基氧發生配位，吸電子誘導效應分別使C=O和N—H鍵間電子云密度下降，鍵力常數變小，致使振動頻率降低，導致νC=O、νN—H和δN—H發生紅移[30-31]。

XPS能夠提供分子結構精確的結合能和共價電子結構信息[32]，利用XPS測試共聚物TPP-1、TPP-2和TPP-4與Eu（Ⅲ）配位前后配位元素氧、氮的鍵合能的變化，可以進一步確定配合物的電子結構和成鍵特性。圖S23分別為TPP-1、TPP-2、TPP-4共聚物與相應的共聚物-Eu（Ⅲ）配合物TPPE-1、TPPE-2、TPPE-4的XPS譜圖以及能譜中相應元素的結合能變化譜圖。由圖S23可以觀察到，配位前后共聚物和共聚物-Eu（Ⅲ）配合物上C元素對應的結合能沒有發生明顯變化，但是N、O兩種元素的結合能發生了改變，從而證明Eu（Ⅲ）可能和共聚物的親水片段 PNIPAM側鏈上的N、O發生配位作用。為了更加清楚地比較共聚物與相應的共聚物-Eu（Ⅲ）配合物中各原子結合能的變化情況，我們將C、N、O和Eu（Ⅲ）結合能數據列于表1中。在單、雙、四臂配合物中上述結合能與對應的未配位聚合物相比，C—N鍵上的N1s結合能分別增大了0.6、0.6、0.9 eV；同時，C=O鍵上的O1s的結合能分別增大了0.7、0.3、1.1 eV，而C元素結合能沒有任何變化。這主要是因為核外電子分布變化會影響內層電子的屏蔽作用，配合物中羰基氧和酰胺氮的電子轉移到Eu（Ⅲ）的外層空軌道上，使其外層電子密度減小，屏蔽作用減弱，內層電子的結合能增加，從而證明了O→Eu3+及N→Eu3+配位鍵的形成[33-34]。此外，在單、雙、四臂配合物的XPS能譜中出現了Eu3d(1 133.3、1 133.5和1 140.0 eV)和Eu4d(136.7、136.8和140.3 eV)的電子結合能，進一步說明Eu配合物的生成。

表1 聚合物TPP-1、TPP-2、TPP-4與配合物TPPE-1、TPPE-2、TPPE-4 中 C1s、O1s、N1s、Eu3d 和Eu4d的鍵能Table 1 Binding energies of C1s,O1s,N1s,Eu3d,and Eu4d for polymers TPP-1,TPP-2,TPP-4,and complexes TPPE-1,TPPE-2,TPPE-4

此外，SEM-EDX是納米材料微區分析的重要手段之一，它可以對材料表面微區成分進行定性、定量分析，其中的EDX元素成像分析技術(EDX-mapping)還可以進行關鍵元素的分布分析。為此，采用SEM-EDX技術對共聚物-Eu（Ⅲ）配合物進行了微區元素分析，結果如圖2所示。其中，圖2a1～2c1分別為TPPE-1、TPPE-2、TPPE-4的SEM-EDX譜圖，由圖可知在3種配合物中含有C、O、N和Eu，其中C、O、N為配合物的主要成分，Eu（Ⅲ）的含量相對較低。采用能譜自帶的軟件對單、雙、四臂配合物的Eu元素質量分數進行計算，質量百分含量約為2.4%、7.2%和11.7%。此外，從配合物中各元素的EDX-mapping圖(圖2a2～2c2)可以觀察到在3種配合物中分布著C、O、N和Eu四種元素，尤其是Eu分布均勻，表明Eu（Ⅲ）均已成功配位于3種共聚物上。

圖2 (a1)TPPE-1、(b1)TPPE-2、(c1)TPPE-4的SEM-EDX譜圖;(a2)TPPE-1、(b2)TPPE-2、(c2)TPPE-4中C、O、N和Eu的EDX-mapping圖Fig.2 SEM-EDX spectra of(a1)TPPE-1,(b1)TPPE-2,and(c1)TPPE-4;EDX-mappings of C,O,N,and Eu of(a2)TPPE-1,(b2)TPPE-2,and(c2)TPPE-4

2.3 單、雙、四臂Pdots自組裝與微觀形貌

本工作所制備的TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4均包含典型的兩親性嵌段共聚物，其中疏水部分由TPE和PCL組成，親水部分由PNIPAM組成，三者均易于在合適的溶液中自組裝形成有序納米結構。在此，我們選擇四氫呋喃為溶劑，超純水為分散介質，采用納米沉淀法制備TPE-PCL-b-PNIPAM-Eu自組裝體，得到外觀均一穩定的TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots，這些Pdots是以疏水的TPE和PCL為核、親水的PNIPAM為外殼的納米小球。

圖 3 為 TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots的TEM圖、粒徑分布圖和水合粒徑動態光散射(DLS)分布圖。從圖3a2～3c2的插圖可以觀察到3種Pdots的水溶液(0.05 mg·mL-1)均具有良好透明性和明顯丁鐸爾效應，表明TPPE-1、TPPE-2和TPPE-4在水溶液中能自組裝形成納米粒子。由圖3a1～3c1可以觀察到 TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots均為規則小球狀，具有較好的分散性，平均粒徑分別為4.8、4.3和2.7 nm。這主要是由于在水溶液中兩親性聚合物鏈發生折疊和塌陷，使聚合物鏈疏水部分收縮包覆于Pdots內部，聚合物鏈親水部分暴露于Pdots的外部，從而自組裝成小球，使得Pdots均勻分散于水相中。同時，由圖3a3～3c3得到Pdots的水合平均粒徑分別為8.7、9.3和5.8 nm，均大于由TEM測試所得的平均粒徑。這主要是因為TEM測得的是干燥的納米粒子的粒徑，而DLS測試的是粒子在水溶液狀態下的粒徑，由于其在水溶液中發生一定的溶脹現象，導致水合粒徑大于干燥粒子粒徑。

圖3 (a1)TPPE-1 Pdots、(b1)TPPE-2 Pdots、(c1)TPPE-4 Pdots的TEM圖;(a2)TPPE-1 Pdots、(b2)TPPE-2 Pdots、(c2)TPPE-4 Pdots的粒徑分布柱狀圖;(a3)TPPE-1 Pdots、(b3)TPPE-2 Pdots、(c3)TPPE-4 Pdots的水合粒徑DLS分布圖Fig.3 TEM images of(a1)TPPE-1 Pdots,(b1)TPPE-2 Pdots,and(c1)TPPE-4 Pdots;Particle size distribution histograms of(a2)TPPE-1 Pdots,(b2)TPPE-2 Pdots,and(c2)TPPE-4 Pdots;Hydrated particle size DLS distribution histograms of(a3)TPPE-1 Pdots,(b3)TPPE-2 Pdots,and(c3)TPPE-4 Pdots

值得注意的是，相比于TPPE-1 Pdots較好的形貌規整度和分散性，TPPE-2 Pdots和TPPE-4 Pdots的粒徑規整度和分散性隨著臂數的增加依次下降，粒徑也不斷降低。這可能是隨著聚合物臂數的增加，共聚物中親水鏈段PNIPAM的含量以及側鏈上N、O原子的密度依次升高，致使共聚物與Eu（Ⅲ）配位能力增強，這與SEM-EDX測試得到的單、雙、四臂配合物中Eu元素質量百分含量依次增加的實驗結果相一致。當Eu（Ⅲ）離子在PNIPAM鏈內或鏈間與N、O原子發生配位時，將會不同程度地引起聚合物鏈的收縮。因此，隨著單、雙、四臂配合物中Eu（Ⅲ）離子含量的逐漸增加，聚合物分子鏈收縮卷曲程度愈嚴重，最終導致Pdots粒徑規整度、分散性和粒徑隨聚合物臂數的增加依次降低。

此外，Pdots的尺寸穩定性對生物成像應用至關重要。為了考察形貌和尺寸的穩定性，我們對放置了30 d的TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots微觀形貌進行測試。從TEM照片可以觀察到被放置30 d的TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots仍呈小球狀分散，平均粒徑為5 nm，表明我們所制備的Pdots具有較好的尺寸穩定性(圖S24)。

2.4 單、雙、四臂Pdots的雙熒光發射

圖4a為四臂共聚物配位前后的UV-Vis吸收光譜圖(單、雙臂共聚物配位前后的UV-Vis吸收光譜圖見圖S25a和S25b)。由圖可知，配位前聚合物在小于500 nm的紫外可見光區有吸收，且隨著波長的增加吸光度不斷下降。而與Eu（Ⅲ）發生配位后，配合物在395 nm處出現了一個強的紫外吸收峰，顯然是由PNIPAM與Eu（Ⅲ）形成的配合物產生的[28]，這也進一步證明Eu（Ⅲ）與兩親性共聚物TPE-PCL-b-PNIPAM發生有效配位。

另一方面，由于 TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots中包含TPE生色團(發射藍光)和稀土Eu（Ⅲ）發光配合物(發射紅光)2種發光單元，如果這2個發光單元發射波長和激發波長差距較大且不發生重疊時，則不會產生熒光共振能量轉移(FRET)現象，那么3種Pdots可能會有雙熒光發射性能。圖4b為20 mg·mL-1的TPPE-4 Pdots水溶液在360～400 nm范圍內不同激發波長下的熒光光譜(TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots水溶液的熒光光譜見圖S25a1和S25b1)。由圖可知，TPPE-4 Pdots能同時發射位于430 nm的藍光和位于615 nm的紅光，證明其具有雙色熒光發射性能。其中，由Eu（Ⅲ）配合物發射的紅色熒光峰是由位于594 nm的弱峰和位于615 nm的強峰所組成，兩者分別對應于Eu3+磁偶極躍遷(5D0→7F1)和電偶極躍遷(5D0→7F2)，尤其是在615 nm處非常強的銳線發射是Eu3+的超靈敏躍遷，具有較好的單色性[33,35]。同時，由圖4c可以清楚地觀測到TPPE-4 Pdots紅、藍熒光強度比I615/I430(I615和I430分別是紅色發射和藍色發射的熒光強度)隨著激發波長的紅移而增大(TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots的紅、藍熒光強度比見圖S25a2和S25b2)。其中，激發波長在360～380 nm范圍內I615/I430＜1，且在360 nm的激發下，I615/I430最小，此時Pdots以發藍光(由TPE發色團產生[27])為主；而當激發波長為390～400 nm時I615/I430＞1，并且在395 nm的激發下，I615/I430最大，此時Pdots以發紅光(由Eu配合物產生[27])為主。因此，TPPE-4 Pdots的藍色和紅色熒光的最佳激發波長為360和395 nm。

圖4 (a)TPPE-4 Pdots水溶液的UV-Vis吸收光譜;(b)不同激發波長下TPPE-4 Pdots的熒光光譜(mTPP-4∶mEu=1∶1);(c)TPPE-4 Pdots溶液在不同激發下的雙發射三維熒光光譜;(d)TPPE-4 Pdots在不同激發下的CIE色度圖Fig.4 (a)UV-Vis absorption spectra of TPPE-4 Pdots in aqueous solution;(b)Fluorescence spectra of TPPE-4 Pdots under different excitation wavelengths(mTPP-4∶mEu=1∶1);(c)Dual-emission 3D fluorescence spectra of TPPE-4 Pdots under different excitations;(d)CIE chromaticity diagram of TPPE-4 Pdots under different excitations

同時，考慮到Pdots中Eu（Ⅲ）的含量會對Pdots水溶液熒光的I615/I430產生影響，我們又考察了制備配合物時不同物料比(共聚物與EuCl3的質量比)與Pdots水溶液熒光光譜中I615/I430的變化關系。如圖S26可知，在不同的激發波長下，3種Pdots水溶液熒光光譜中I615/I430均隨著EuCl3與共聚物的質量比增大而升高，這是體系中Eu配合物含量增大使紅色熒光增強引起的。很明顯，當EuCl3與共聚物的物料比為1∶1時，可實現Pdots水溶液在360 nm激發下I615/I430很小的同時在395 nm激發下I615/I430很大，這樣更有利于獲得在2個不同激發波長下的最佳雙色熒光發射效果。圖4d為EuCl3與TPP-4的物料比為1∶1時所得Pdots水溶液熒光相應的CIE色度圖(TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots水溶液的CIE色度圖見圖S25a3～S25b3)。由圖可知，隨著激發波長在360～400 nm范圍內紅移，標注在標準色板上的復合光由藍色漸變為紅色，且熒光位點較好地處于一條直線上，表明可逆地調控發光顏色是可以通過調節3種Pdots的激發波長來實現的。

因此，光學測試結果表明，TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots在360 nm的激發下主要以430 nm處藍光發射為主，而在395 nm激發時則主要以615 nm處紅光發射為主，且藍、紅光發射波長間距高達195 nm，相互干擾較小，表現出優異的雙熒光性質。更重要的是我們可以僅僅通過調節激發波長輕松實現Pdots發光顏色的可逆調控，使其在多通道生物成像領域具有較大的應用空間。此外，與TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots相比，TPPE-4 Pdots水溶液復合熒光顏色變化區間更寬，具有更好的雙熒光效果，這有利于提高細胞成像的分辨率。

2.5 單、雙、四臂Pdots的溫敏性

PNIPAM是一種典型的溫度響應型聚合物，在生物醫學領域中被廣泛應用。由于其分子鏈上同時具有親水性的酰胺基和疏水性的異丙基，當溫度升高至32℃以上時，PNIPAM的疏水性以及氫鍵的劇變會使其構象由親水的膨脹態急劇轉變為疏水的收縮態，此時水溶液會產生急劇的相變，該溫度被稱為PNIPAM的最低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature，LCST)[36-38]。因此，含有PNIPAM結構的TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots也應該具有相似的溫度敏感特性。為了考察3種Pdots的溫敏性，我們首先測試在10～60℃區間內升溫過程中Pdots水溶液的透光率變化情況。圖5a為TPPE-4 Pdots水溶液的透光率隨溫度變化曲線(TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots水溶液的透光率隨溫度變化曲線見圖S27a1和S27b1)。可以看出，在10～30℃區間內，TPPE-4 Pdots水溶液為澄清透明溶液，透光率接近100%。但隨著溫度的進一步升高，透明溶液漸漸變渾濁，透光率開始下降。溫度超過40℃，變成白色乳狀懸浮液。當升溫到60℃后又慢慢冷卻到20℃時，白色乳狀懸浮液變成未升溫前的澄清透明溶液狀態。

然而，測試結果表明3種Pdots溶液的LCST并不相同，TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots的LCST分別約為32、36和37℃。很明顯，3種Pdots的LCST隨著鍵合于TPE分子上聚合物臂數的增加而升高。我們認為這可能是由于體系中Eu3+含量的變化導致的。對于PNIPAM含量較低的TPPE-1 Pdots，Eu3+的摻雜量相對較少，因而對PNIPAM的熱敏性影響很小，使其LCST接近于PNIPAM的LCST。但是TPPE-2和TPPE-4 Pdots中PNIPAM含量增大，引起Eu3+含量的升高，從而對PNIPAM的熱敏性產生較大的影響，致使兩者的LCST分別升高了4和5℃。這可能是由于稀土離子Eu3+的配位能力較強，在水溶液中Eu3+不僅能與PNIPAM側鏈酰胺上的O和N原子發生配位，同時也與水分子上的O發生一定配位作用。而配位鍵鍵能比氫鍵鍵能大，因此當體系溫度升高至LCST附近時，就需要更多的能量才能破壞水分子與Eu3+之間的配位作用力，導致雙臂和四臂Pdots在更高的溫度才會發生相轉變，使LCST升高。與此同時，我們又考察了3種Pdots的相變可逆性。圖5b分別為在4次升-降溫循環過程中TPPE-4 Pdots水溶液分別處于20和40℃時的透光率變化圖(TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots水溶液的透光率變化圖見圖S27a2和S27b2)。由圖可知，在溫度(20℃)低于LCST時，Pdots可完全溶于水；溫度(40℃)高于LCST時，Pdots從水中析出，呈乳液狀；再次降溫至20℃時，Pdots溶液又恢復到澄清透明狀態，且在多次循環中表現出可逆的相轉變能力。值得注意的是，TPPE-4 Pdots的LCST更接近人體的正常體溫，且具有良好的可逆性，因此是一種優異的溫敏型納米材料。

圖5 (a)不同溫度下TPPE-4 Pdots水溶液的透射率;(b)TPPE-4 Pdots水溶液在不同溫度下的可逆相變圖;(c)TPPE-4 Pdots水溶液(10 mg·mL-1)在不同溫度下的熒光光譜(λex=360 nm);(d)不同溫度下TPPE-4 Pdots水溶液的藍、紅發射光的熒光強度Fig.5 (a)Transmittance of TPPE-4 Pdots aqueous solution at different temperatures;(b)Reversible phase transition diagram of TPPE-4 Pdots aqueous solution at different temperatures;(c)Fluorescent spectra of TPPE-4 Pdots aqueous solution(10 mg·mL-1)at different temperatures(λex=360 nm);(d)Fluorescence intensities of blue and red emission from aqueous solutions of TPPE-4 Pdots at different temperatures

此外，為了考察Pdots雙熒光隨溫度變化情況，我們對TPPE-4 Pdots水溶液進行了變溫熒光光譜的測試，結果如圖5c和5d所示(TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots水溶液的變溫熒光光譜圖見圖S27a3、S27a4、S27b3、S27b4)。由雙熒光強度隨溫度的變化趨勢圖可以觀察到，隨著溫度的升高，TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots藍色熒光強度逐漸降低，而紅色熒光強度則略有升高，但變化相對較弱，這可能是由于從Eu3+的發射5D0能級到非輻射三重態的熱活化[39-40]。通過仔細觀察藍色熒光在LCST附近的變化，我們還發現當TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots水溶液溫度低于LCST時，其藍色熒光強度會隨著溫度的上升而呈規律性下降趨勢，但當環境溫度超過其各自的LCST(32或36℃)后，其藍光強度突然增強，然后又繼續隨著溫度的升高而下降。引起這一反常現象的原因可能是溫度的升高將會加速有機熒光小分子TPE的分子內旋轉，增強非輻射躍遷程度，進而使藍色熒光發射強度降低。而當體系溫度高于LCST時，Pdots上PNIPAM鏈的構象由親水的膨脹態急劇轉變為疏水的收縮態，導致鏈上TPE聚集程度增強，引起AIE效應，從而使Pdots的藍光增強。但隨著繼續升溫，高溫下TPE的分子內旋轉導致熒光下降的程度高于AIE效應致使熒光上升的程度，導致藍色熒光的強度再次下降。相比于TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots基于AIE展現出的明顯變化，TPPE-4 Pdots在LCST附近并沒有發生藍光增強，僅僅表現出熒光強度下降趨勢變緩。我們認為這可能是由于TPE在TPPE-4中相對含量較低，AIE響應較弱。由此可見，具有溫敏性的PNIPAM鏈使Pdots水溶液熒光也具有了優異的溫度響應性，由此可以說明我們合成的3種Pdots不僅具有TPE的AIE特性，同時還擁有PNIPAM的溫敏特性，這為設計新型的具有功能性的AIE型高分子材料拓展了一種新的設計思路。

2.6 三種Pdots的細胞毒性及雙色細胞成像

具有雙熒光發射功能的TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots的細胞毒性是決定其能否成功應用于細胞成像的前提條件。我們首先選取3種不同類型的腫瘤癌細胞(人宮頸癌細胞HeLa、人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2)作為測試Pdots細胞毒性的樣本，采用MTT法對TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots的細胞毒性進行了測試，結果如圖6a1～6c1所示。當分別將HeLa、A549和HepG2腫瘤細胞置于50～400 μg·mL-1的Pdots水溶液中培養48 h后，對所有培養濃度來說，3種腫瘤細胞活性均在90%以上，這表明TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots對腫瘤細胞具有較低的細胞毒性，可以進一步應用于細胞成像實驗。

在進行細胞成像實驗時，先在生理環境下將HeLa、A549 和 HepG2 置于 100 μg·mL-1的 TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots水溶液中培養24 h，然后使用熒光顯微鏡拍攝不同激發光源照射下的細胞熒光顯微照片，如圖6a2～6c2所示。通過熒光顯微照片，我們可以清楚地觀察到：經由TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots染色后的 HeLa、A549和HepG2細胞在藍色通道的激發光照射下，均可在細胞內接收到強烈的藍色熒光信號；而當在紅色通道的激發光照射下，3種細胞則呈現出強烈的紅色熒光，即通過采用不同的激發波長，被Pdots染色的腫瘤細胞具有實現藍/紅雙色熒光成像的能力，且這種雙色成像同時具有很好的可逆性。同時，細胞成像測試結果證明：3種Pdots均可通過細胞內吞作用穿透細胞膜，從而進入HeLa、A549和HepG2細胞中進行染色，并呈現出幾乎完整的細胞形態。此外，通過對圖6a2～6c2的仔細觀察，可以發現TPPE-4 Pdots在HepG2、A549和HeLa三種細胞內的成像效果均優于TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots。其中，TPPE-4 Pdots可對HepG2和A549細胞的細胞質進行染色，且在細胞質區域內熒光強度較強，呈現的細胞形態幾乎完整，尤其對HepG2細胞具有較高的成像分辨率。這可能是由于TPPE-4 Pdots具有最小的粒徑和最優的雙熒光效果，更容易被細胞吞噬并表現出最佳的雙色成像效果。因此，TPPE-4 Pdots是一種優良的細胞成像熒光納米材料。除此之外，在測試中對染色后的3種細胞進行長時間照射后，細胞內所發射的藍/紅雙色熒光強度幾乎不變，表明所制備的Pdots具有很好的抗光漂白性。

圖6 Hela、A549和HepG2細胞的雙色共定位圖像:用不同濃度(a1)TPPE-1 Pdots、(b1)TPPE-2 Pdots、(c1)TPPE-4 Pdots處理48 h后Hela、A549和HepG2細胞的毒性測試;用(a2)TPPE-1 Pdots、(b2)TPPE-2 Pdots、(c2)TPPE-4 Pdots(100 μg·mL-1)處理24 h的Hela、A549和HepG2細胞的藍/紅雙通道熒光顯微鏡圖像Fig.6 Dual-color co-localization images of Hela,A549,and HepG2 cells:cytotoxic tests for the cells treated with different concentrations of(a1)TPPE-1 Pdots,(b1)TPPE-2 Pdots,and(c1)TPPE-4 Pdots for 48 h,respectively;Blue/red dual-channel fluorescence microscope images of the cells treated with(a2)TPPE-1 Pdots,(b2)TPPE-2 Pdots,and(c2)TPPE-4 Pdots for 24 h,respectively

目前，市場開發和文獻報道的細胞熒光染料多為單色顯影劑，相比之下，本工作所制備的3種小尺寸Pdots納米熒光粒子因具有智能的可逆雙色熒光切換功能，使其具有高時空分辨率和高抗干擾性等優勢。因而，TPPE-1 Pdots、TPPE-2 Pdots、TPPE-4 Pdots三種納米熒光探針在生物熒光成像領域均顯示出重要的應用價值。

3 結論

首先通過原位引發聚合方法分別合成單、雙、四臂型兩親性嵌段共聚物：TPP-1、TPP-2和TPP-4。然后利用稀土元素Eu與嵌段共聚物側鏈富含N、O原子的親水片段PNIPAM發生配位，分別合成嵌段共聚物-Eu（Ⅲ）配合物：TPPE-1、TPPE-2和 TPPE-4。最后，通過配合物在水中自組裝成功制備非半導體型Pdots。3種Pdots均具有優異的水溶性和低于5 nm的超小粒徑。光學測試結果表明：單、雙、四臂Pdots在360 nm的激發下主要以430 nm處藍光發射為主，而在395 nm時則主要以615 nm處紅光發射為主，藍、紅光發射波長間距高達195 nm，相互干擾較小，表現出優異的雙熒光性質。此外，由于Pdots中PNIPAM鏈的構象隨溫度升高由膨脹態轉變為收縮態，導致鏈上TPE聚集程度增強，從而賦予Pdots水溶液熒光的溫度響應性。同時，細胞毒性及細胞成像研究表明，3種Pdots均具有低細胞毒性，并可通過細胞內吞作用分別進入HeLa、A549和HepG2腫瘤細胞中進行染色，在不同的激發波長下，可在細胞內接收到強烈的藍色或紅色熒光信號，呈現出幾乎完整的細胞形態，展現出優異的藍/紅雙色熒光成像的能力和可逆雙色熒光切換功能。

此外，通過對比3種Pdots的結構和性質，發現如下變化規律：(1)隨著聚合物臂數的增加，Pdots中Eu（Ⅲ）的含量升高；(2)隨著聚合物臂數的增加，Pdots水溶液復合熒光顏色變化區間依次變寬；(3)隨著聚合物臂數的增加，增強的Eu（Ⅲ）配位鍵鍵能導致Pdots的LCST依次升高，且TPPE-4的LCST更接近人體體溫，具有良好的可逆性；(4)粒徑最小、雙熒光效果最優的TPPE-4更容易被細胞吞噬，表現出最佳的雙色成像效果，是一種良好的活細胞雙色熒光顯影劑，在熒光傳感、生物成像及臨床生物醫學材料研究等領域具有較大的應用前景。

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