HPLC法同時測定銀花感冒顆粒中8種成分

胡小祥， 何 艷， 劉冠瓊， 曾凡紅， 劉 帥

(1.郴州市食品藥品檢驗檢測中心，湖南 郴州 423000；2.湘南學院藥學院，湖南 郴州 423000；3.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003)

銀花感冒顆粒收載于《衛生部藥品標準》(中藥成方制劑第二冊)，由金銀花、連翹、防風葉、桔梗、甘草5味藥材組成，具有清熱、解表、利咽之功效，用于治療感冒發熱、頭痛、咽喉腫痛[1]，但該制劑現行質量標準中僅有顆粒劑常規檢查，無含量測定項；文獻[2-6]也僅對綠原酸、連翹苷、連翹酯苷A、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸中的1種或幾種進行定量分析，不能全面反映其內在質量。方中金銀花功效清熱解毒、疏散風熱，主要活性成分有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、3,4-二-O-咖啡酰奎寧酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸等[7-9]，而連翹功效辛涼解表、清熱解毒，主要活性成分有連翹苷、連翹酯苷A[10-12]，兩者合為君藥；防風功效祛風解表、勝濕止痛，主要活性成分有升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷[13-14]，為臣藥；桔梗功效宣肺、利咽，主要活性成分有桔梗皂苷D[15-16]，為佐藥；甘草功效補脾益氣、清熱解毒、調和諸藥，主要活性成分有甘草苷、甘草酸[17-18]，為使藥。為了全面控制和評價銀花感冒顆粒內在質量，本實驗采用HPLC法同時測定該制劑中新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸的含量，以期為其質量標準的提高和完善提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(配置G1311B四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1315D 二極管陣列檢測器，美國Agilent公司)；XSE-205電子天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 綠原酸(批號110753-201817，純度96.8%)、升麻素苷(批號111522-201913，純度94.6%)、連翹酯苷A(批號11810-202108，純度97.2%)、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸(批號111782-201807，純度94.3%)、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號111523-201811，純度97.4%)、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸(批號1118941-202104，純度95.1%)、甘草酸銨(批號110731-202021，純度96.2%)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸(批號MUST-21030108，純度99.67%)對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。銀花感冒顆粒(批號20200928、20200423，A公司；批號200209，B公司；批號20201001，C公司)，每袋裝20 g，有效期3年。甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；乙酸、磷酸為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為怡寶純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相[乙腈-甲醇(6∶4)](A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫(0～10 min，9%A；10～20 min，9%～20%A；20～25 min，20%A；25～40 min，20%～32%A；40～52 min，32%～55%A；52～65 min，55%～60%A；65～66 min，60%～6%A；66～70 min，9%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm(升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸)、327 nm(新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸)；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品新綠原酸7.68 mg、綠原酸8.44 mg、升麻素苷6.70 mg、連翹酯苷A 8.78 mg、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸7.51 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷8.09 mg、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸8.11 mg、甘草酸銨7.96 mg(甘草酸含量=甘草酸銨含量/1.020 7)，置于25 mL量瓶中，70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取2、2.5、2、5、1、2、1.5、2.5 mL至同一20 mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得(含新綠原酸30.62 μg/mL、綠原酸40.85 μg/mL、升麻素苷25.35 μg/mL、連翹酯苷A 85.34 μg/mL、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸11.69 μg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷31.52 μg/mL、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸21.60 μg/mL、甘草酸39.02 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，混勻，研細，取粉末約2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲(功率500 W、頻率40 kHz)處理20 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照處方比例和工藝，分別制備缺金銀花、缺連翹、缺防風、缺甘草的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性試驗 取“2.2”項下對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，供試品溶液色譜圖在對照品溶液色譜圖相同保留時間處有色譜峰出現，各成分色譜峰與雜質峰之間的分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

1. 新綠原酸 2. 綠原酸 3. 升麻素苷 4. 連翹酯苷A 5.3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸 6.5-O-甲基維斯阿米醇苷橙皮苷7.4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸 8. 甘草酸1. neochlorogenic acid 2. chlorogenic acid 3. prim-O-glucosylcimifugin 4. forsythiaside A 5.3,5-O-dicaffeoylquinic acid6.5-O-methylvisammioside 7.4,5-O-dicaffeoylquinic acid 8. glycyrrhizic acid圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，得6個質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液適量，70%甲醇稀釋2倍，0.45 μm微孔濾膜過濾，在“2.1”項下色譜條件進樣測定6次，測得新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸峰面積RSD分別為0.43%、0.64%、0.61%、0.42%、1.01%、0.31%、0.98%、1.08%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取本品(批號20201001)適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、4、10、18、24、30 h在“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸峰面積RSD分別為1.86%、0.56%、0.76%、0.59%、1.26%、0.49%、0.86%、1.44%，表明溶液在30 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取本品(批號20201001)適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸含量RSD分別為0.41%、0.24%、0.20%、0.57%、1.75%、0.41%、0.49%、0.25%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品(批號20201001)6份，每份約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，每份按100%水平加入對照品溶液(0.161 1 mg/mL新綠原酸1 mL、0.392 6 mg/mL綠原酸1 mL、0.130 9 mg/mL升麻素苷1 mL、0.310 3 mg/mL連翹酯苷A 3 mL、0.087 60 mg/mL 3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸 1 mL、0.151 6 mg/mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷1 mL、0.132 6 mg/mL 4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸 1 mL、0.192 8 mg/mL甘草酸1 mL)，70%甲醇補足至25 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸平均加樣回收率分別為103.57%、98.32%、100.41%、100.89%、97.59%、100.55%、99.54%、102.24%，RSD分別為2.18%、2.02%、2.29%、2.10%、1.60%、1.66%、1.54%、2.49%。

2.9 樣品含量測定 取5批樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備3份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents(mg/g，n=3)

3 討論

3.1 指標成分篩選 課題組前期對銀花感冒顆粒組方藥材中的有效成分進行預實驗，發現隱綠原酸及3,4-二-O-咖啡酰奎寧酸(金銀花)、連翹苷(連翹)、甘草苷(甘草)、桔梗皂苷D(桔梗)不能實現同時檢測。最終確定，新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸作為指標成分。

3.2 色譜條件篩選 本實驗采用DAD檢測器，在200～400 nm波長范圍內進行掃描，發現新綠原酸、綠原酸、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸最大吸收波長為327 nm，連翹酯苷A為330 nm,升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷為254 nm，甘草酸為250 nm，最終確定254、327 nm作為檢測波長。再考察Agilent Zorbax-C18、Thermo Acclaim-C18、SHIMADU Shim-pack-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對各成分分離度的影響，發現均在Agilent Zorbax-C18色譜柱中效果最好。然后考察流動相，發現單用甲醇或乙腈時，3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷色譜峰有重疊現象，而采用兩者混合溶劑(比例6∶4)后三者能實現較好的分離。

3.3 供試品溶液制備方法篩選 本實驗考察不同體積分數甲醇和乙醇(80%、70%、60%)、提取方法(超聲、回流)、提取時間(20、30、40、60 min)、溶劑用量(25、50 mL)對各成分提取率和色譜峰峰形的影響，最終確定供試品溶液制備方法為20 mL 70%甲醇超聲提取20 min。

3.4 含量分析 表1顯示，5批樣品中含量差異最大成分的為連翹酯苷A，這可能與連翹采收時間(青翹、老翹)有關，需引起關注。

4 結論

本實驗建立HPLC法同時測定銀花感冒顆粒中新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、連翹酯苷A、3,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、5-O-甲基維斯阿米醇苷、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸、甘草酸的含量，能較全面地反映該制劑內在質量。但不足之處在于樣本量過少，今后將收集更多批次樣品，以期制定銀花感冒顆粒中各有效成分的含量限度。