HPLC-DAD法同時測定狼毒二鱉消積湯中6種成分

楊浩然， 岳秀永， 付正豐*

(1.重慶三峽醫藥高等?？茖W校，重慶 404020；2.重慶大學附屬三峽醫院，重慶 404000)

狼毒二鱉消積湯系重慶三峽醫藥高等?？茖W校楊德全教授經驗方，由瑞香狼毒、木鱉子、鱉甲、紅豆杉、藤梨根等藥材組成，臨床上用于中晚期肝癌患者的治療，方中狼毒[1]、木鱉子[2]、鱉甲[3-4]活血化瘀通絡、破結軟堅，紅豆杉[5]、藤梨根[6]清熱解毒抗癌，全方具有扶正抗癌之功效。經長期臨床應用驗證，該方在改善患者臨床癥狀、減輕痛苦、延長生存期等方面療效確切，有一定的推廣價值。

目前，狼毒二鱉消積湯尚缺乏關于質量控制方面的研究。為了保證用藥有效性和安全性，本實驗參考文獻[2,7-9]報道和前期研究結果，選擇瑞香狼毒中新狼毒素A和狼毒素、藤梨根和木鱉子中齊墩果酸、藤梨根中熊果酸、曼地亞紅豆杉中三尖杉寧堿和紫杉醇作為指標，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測法(HPLC-DAD)測定上述成分含量，以期為狼毒二鱉消積湯質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，配置G1312A二元泵、G1329A自動進樣器、G1315B二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)；5430R離心機(德國Eppendorf公司)；R200D電子天平(德國Sartorius公司)；KQ-300DE型醫用超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；FW177型中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 狼毒素A(批號19082135)、狼毒素(批號19012418)對照品購自武漢中標科技有限公司；齊墩果酸(MUST-16082517)、熊果酸(MUST-16011712)對照品購自成都曼思特生物科技有限公司；三尖杉寧堿(批號100926-201812)、紫杉醇(批號100382-201907)對照品購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。狼毒、鱉甲、木鱉子、曼地亞紅豆杉、藤梨根均購自重慶中藥材有限公司，經三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為正品，均符合2020年版《中國藥典》規定。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 迪馬Platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.05%三氟乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～30 min，25%～55%B；30～56 min，55%～90%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm(齊墩果酸、熊果酸)、227 nm(三尖杉寧堿、紫杉醇)、290 nm(新狼毒素A、狼毒素)；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇對照品適量，加甲醇制成各成分質量濃度分別為680.2、422.5、1 508、1 072、75.66、17.82 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 根據處方稱取狼毒3.0 g、木鱉子10.0 g、鱉甲12.0 g、紅豆杉5.0 g、藤梨根50.0 g，10倍量水(800 g)浸泡30 min，大火煎開后轉小火煎煮1 h，濾過，再加8倍量水同法煎煮1 h，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL(生藥量0.8 g/mL)，吸取濃縮液10 mL，甲醇稀釋至20 mL，混勻，10 ℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 取缺狼毒、缺木鱉子、缺藤梨根、缺紅豆杉陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度良好(均大于1.6)，理論塔板數按各成分計均大于3 000，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對質量濃度(X)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 精密吸取同一份對照品溶液20 μL(含新狼毒素A 68.02 μg/mL、狼毒素42.25 μg/mL、齊墩果酸150.8 μg/mL、熊果酸107.2 μg/mL、三尖杉寧堿7.566 μg/mL、紫杉醇1.782 μg/mL)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇峰面積RSD分別為1.02%、0.89%、1.58%、1.71%、1.80%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取處方藥材適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇峰面積RSD分別為2.64%、2.18%、2.05%、2.57%、3.28%、3.76%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗 取同一批藥材，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇峰面積RSD分別為3.20%、2.71%、3.09%、3.11%、2.12%、3.28%，表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的對半量處方藥材，即狼毒1.5 g、木鱉子5 g、鱉甲6 g、紅豆杉2.5 g、藤梨根25 g，加入“2.2.1”項下對照品溶液10 mL，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇平均加樣回收率分別為97.62%、96.57%、101.34%、96.31%、94.52%、102.08%，RSD分別為2.05%、2.18%、2.97%、2.13%、3.52%、4.02%。

2.9 樣品含量測定 取處方藥材適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，代入表1回歸方程，并折算成“2.2.2”項下濃縮液(甲醇稀釋前)中各成分含量，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果(μg/mL)Tab.2 Results of content determination of various constituents(μg/mL)

3 討論

3.1 檢測指標選擇 狼毒具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等活性[1]，但它有毒性，在畜牧業中被視為毒草[10-11]，所含新狼毒素A、狼毒素等黃酮類成分既具有抗癌作用，又為毒性來源[1,7]；藤梨根是常用的抗腫瘤中藥[6,12-13]，所含齊墩果酸、熊果酸具有抗癌、護肝等作用[6,14]；木鱉子中齊墩果酸為主要成分之一[15-16]；紅豆杉含有紫杉醇和三尖杉寧堿，具有很好的抗腫瘤活性[5,9]，故本實驗選擇上述6種成分作為檢測指標。另外，鱉甲具有軟堅散結的功效[3,4,17-18]，但其定性鑒別和定量測定方法難以與本實驗統一，故未涉及該藥材，需另行開展研究。

3.2 色譜條件選擇 本實驗在參考文獻[2,7-9,19]和預實驗基礎上，考察了水相體系0.1%甲酸、0.1%磷酸鹽緩沖液、0.05%三氟乙酸，發現0.05%三氟乙酸可使各成分得到良好分離，色譜峰對稱性理想，故采用0.05%三氟乙酸-乙腈作為流動相進行梯度洗脫。然后，采用二極管陣列檢測器(DAD)在200～400 nm波長范圍內對6種成分進行掃描，確定了最大吸收波長，再通過多波長切換方式進行檢測。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實驗參考文獻[20]，考察了不同溶劑(不同體積分數甲醇、乙醇)、提取方式(超聲、熱提)，基于提取效率、減少雜質、操作簡便等方面的考慮，確定供試品溶液制備方法為藥材煎煮濃縮后先加甲醇低溫離心，再用微孔濾膜過濾。

4 結論

本實驗建立了HPLC-DAD法同時測定狼毒二鱉消積湯中新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇的含量，該方法簡便、準確、可靠，可為該方質量控制和深入開發提供參考。