益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響

陳 昕， 李小雪， 俞佳利， 李屹龍， 孫琳潔， 薛金貴*

(1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管科，上海 201203；2.上海市第七人民醫院，上海 200120)

動脈粥樣硬化是導致人類心血管疾病發病率和死亡率居高不下的病因之一[1]，其形成與血脂水平升高、動脈壁膽固醇累積、長期慢性炎癥有關[2]，其中脂質代謝功能失調占據了重要地位。膽固醇逆轉運是脂質代謝的重要途徑，對于維持機體的脂質代謝穩態有著重大意義[3]。研究表明，肝X受體α(liver X receptor，LXRα)可通過調控ATP轉運蛋白A1/G1(ATP binding cassette transporter A1/G1,ABCA1/G1)的表達，將細胞內過多的膽固醇經由血漿高密度脂蛋白(HDL-C)轉運至肝臟，經糞便清除從而改變膽固醇逆轉運過程[4-7]，同時LXRα可以通過調控固醇調節元件結合蛋白1(terol regulatory element binding protein-1，SREBP1)介導的多種脂肪合成酶的合成，減少脂肪堆積。因此，干預膽固醇逆轉運過程，可能對動脈粥樣硬化的防治具有重要意義。

益氣活血化痰方由黃芪、丹參、全瓜蔞、水蛭、黃連組成，具有調節脂質平衡、抑制炎癥反應、穩定粥樣斑塊的功效，可減少冠脈事件的發生[8-11]，但其具體作用靶點尚未明確。本研究在前期實驗基礎上，用高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠以建立早期動脈粥樣硬化模型，探究益氣活血化痰方抗動脈粥樣硬化的機制。

1 材料

1.1 動物 72只8周齡雄性ApoE-/-小鼠，體質量27～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，SPF級環境，溫度(22±1)℃，相對濕度(50±5)%，晝夜12 h/12 h，自由進食飲水。實驗經上海中醫藥大學實驗動物福利與倫理委員會審查通過，倫理審查編號PZSHUTCM190308018。

1.2 試劑與藥物 益氣活血化痰方由生黃芪30 g、丹參20 g、全瓜蔞15 g、水蛭9 g、黃連6 g組成，藥材購自上海中醫藥大學附屬曙光醫院，由醫院制劑室制成浸膏粉，每1 g相當于生藥量2.96 g。阿托伐他汀(20 mg/片，美國輝瑞公司，批號AF3465)碾碎，過分樣篩100目篩后置于含0.5%羧甲基纖維素鈉的雙蒸水中，制成混懸劑。HE染液(國藥集團化學試劑有限公司，批號2019001)；載脂蛋白A1(APOA1)檢測試劑盒(上海泛柯實業有限公司，批號2019006)；Masson染液(批號G1006)、油紅O染液(批號G1016)均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；總膽固醇(TC)(批號20181207)、甘油三酯(TG)(批號20181208)、高密度脂蛋白(HDL-C)(批號20190105)、低密度脂蛋白(LDL-C)(批號20190104)、極低密度脂蛋白(VLDL-C)試劑盒(批號20190105)均購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒(批號M1119290)、逆轉錄試劑盒(批號H4104750)均購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號7E501C1)。

1.3 儀器 切片分析系統(日本Olympus公司，型號BX51)；輪轉切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號LEICA 819)；冰凍切片機(中國賽默飛世爾科技有限公司，型號CRYOSTAR NX50)；高速冷凍離心機(美國貝克曼庫爾特公司，型號AVANTI J-15R)；Western blot電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(美國Bio-Tek公司，型號Synergy H1)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號StepOnePlus)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 小鼠隨機分成6組，每組12只，分別為空白對照組、模型組、阿托伐他汀組及益氣活血化痰方低、中、高劑量組，空白對照組給予普通飲食喂養，其余5組給予高脂飼料(21.8%脂肪，1.25%膽固醇，76.95%標準飼料)，適應性飼養1周后開始造模。根據動物與人的等效劑量換算，以等效劑量為中劑量，益氣活血化痰方低、中、高劑量組分別灌胃給予相應藥物混懸液7.7、14.14、28.28 g/kg，給藥量為0.5 mL/20 g，阿托伐他汀組灌胃給予2.98 mg/kg混懸液，空白對照組和模型組灌胃給予等量雙蒸水，每天1次。給藥前1天上午8點稱定各組小鼠體質量，之后每周早上相同時間稱定1次，并在取材前稱定最后1次。連續灌胃給藥14周后處死小鼠,并取材。

2.2 指標檢測

2.2.1 HE染色 取小鼠主動脈組織，置于預先配好的4%多聚甲醛中固定24 h，70%～100%梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，切片、貼片后脫蠟染色，蘇木精染色，酸水及氨水分化，流水沖洗，置于70%、90%乙醇中各脫水10 min，伊紅染色液染色2～3 min；染色后的切片經無水乙醇脫水，再經二甲苯透明，最后樹膠封固，在顯微鏡下觀察，并采用Image J軟件對血塊剖面斑塊面積進行定量分析。

2.2.2 Masson染色 將小鼠主動脈石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、70%乙醇中脫蠟至水，重鉻酸鉀染色，浸泡過夜，鐵蘇木素染液染色，分化液分化，返藍液返藍，麗春紅酸性品紅浸染5～10 min，磷鉬酸水浸染1～3 min，苯胺藍染色，1%冰醋酸分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，在顯微鏡下觀察，采集圖像。結果，膠原纖維呈藍色，肌纖維、纖維素和紅細胞呈紅色。

2.2.3 油紅O染色 將小鼠主動脈冷凍切片復溫干燥，固定15 min后水洗，晾干，油紅染液浸染，75%乙醇分化，蘇木素染液染3～5 min，分化液分化，返藍液返藍，流水沖洗，甘油明膠封片劑封片，在顯微鏡下觀察，采集圖像。結果，脂滴呈橘紅色至鮮紅色，細胞核藍色。

2.2.4 血脂水平檢測 取小鼠全血樣本，3 000 r/min離心5 min，取血清，按試劑盒說明書檢測TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、APOA1水平，計算動脈粥樣硬化指數(atherosclerosis index，AI)。

2.2.5 Western blot檢測小鼠主動脈組織相關蛋白表達 采用RIPA裂解液裂解小鼠主動脈組織，提取總蛋白，BCA法檢測主動脈組織蛋白濃度，每泳道20 μg蛋白進行上樣，經SDS-PAGE電泳后，濕轉至PVDF膜，5% BSA封閉，按推薦比例配制LXRα、SREBP1、ABCG1、ABCA1一抗，在4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜4次，二抗常溫孵育1 h，加入ECL發光液，應用化學發光成像系統曝光并采集圖片，采用Image J對圖像進行定量分析。

2.2.6 RT-qPCR檢測小鼠主動脈組織相關基因表達 提取小鼠主動脈組織總RNA，并逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR檢測，反應條件為預變性，95 ℃ 30 s；擴增反應，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；熔解曲線，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCT法對結果進行相對定量分析。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表1。

3 結果

3.1 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠主動脈斑塊面積的影響 如圖1所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈壁增厚且可見斑塊形成，而益氣活血化痰方各劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動脈未見明顯斑塊。

圖1 各組ApoE-/-小鼠主動脈板塊面積(HE,×200)Fig.1 Aortic plaque areas of ApoE-/- mice in each group(HE,×200)

3.2 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠主動脈膠原纖維水平的影響 如圖2所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈膠原纖維水平升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動脈膠原纖維水平降低(P<0.01)。

3.3 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠主動脈脂質蓄積水平的影響 如圖3所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈脂質蓄積水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動脈脂質蓄積水平均降低(P<0.01)

3.4 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 如圖4所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠血清TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.01)；益氣活血化痰方高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠血清VLDL-C水平降低(P<0.05，P<0.01)，HDL-C、APOA1水平均升高(P<0.01)。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖2 各組ApoE-/-小鼠主動脈膠原纖維水平Fig.2 Levels of aortic collagen fiber of ApoE-/- mice in each group(Masson,×200, n=12)

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。圖3 各組ApoE-/-小鼠脂質蓄積水平(油紅Fig.3 Levels of lipid accumulation of ApoE-/- mice in each group(oil red O,×200, n=12)

3.5 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化指數的影響 如圖5所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化指數均升高(P<0.01)；與模型組比較，益氣活血化痰方高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化指數均降低(P<0.01)。

3.6 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠主動脈組織LXRα、ABCA1、ABCG1、SREBP1蛋白表達的影響 如圖6所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα蛋白表達降低(P<0.01)，ABCA1、ABCG1、SREBP1蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，益氣活血化痰方各劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα、ABCA1、ABCG1、SREBP1蛋白表達均升高(P<0.05，P<0.01)。

3.7 益氣活血化痰方對ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1、ABCG1 mRNA表達的影響 如圖7所示，與空白對照組比較，模型組ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα、ABCA1、ABCG1 mRNA表達降低(P<0.01)，SREBP1 mRNA表達無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，益氣活血化痰方中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1、ABCG1 mRNA表達均升高(P<0.01)。

4 討論

現代研究表明，血漿膽固醇水平與動脈粥樣硬化斑塊的發生發展呈正相關[12]，其中粥樣斑塊的形成多與LDL-C密切相關，而HDL-C可以通過逆向轉運膽固醇，抗氧化，改善血管內皮功能等發揮抗動脈粥樣硬化作用[13-14]；APOA1是血漿HDL-C的主要載脂蛋白，在膽固醇逆轉運中發揮關鍵作用[15-16]；動脈粥樣硬化指數可以體現人體血管承受的壓力與可擴張性，與機體動脈粥樣硬化的嚴重程度呈正相關[17-19]。本研究結果表明，與空白對照組比較，模型組小鼠血清脂質水平升高，HE染色可見明顯斑塊，說明小鼠動脈粥樣硬化模型建立成功。益氣活血化痰方干預后可以減少ApoE-/-小鼠主動脈內壁脂質蓄積，降低膠原纖維、TC、LDL-C水平和動脈粥樣硬化指數，而對HDL-C、APOA1水平具有升高作用。

膽固醇逆轉運是機體排出多余膽固醇的重要生理途徑，是緩解動脈粥樣硬化的新策略[2]。LXR可將細胞內過多的膽固醇通過血漿HDL-C轉運至肝臟進行轉化、清除，從而發揮抗動脈粥樣硬化作用[20]；LXRα與視黃醛X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體后，與SREBP1啟動子上游的LXR反應元件結合，從而調控SREBP1的轉錄，促進多種脂肪合成酶的合成[21]；LXRα調控SREBP1的同時，還可以升高ABCA1/G1的表達，并呈時間和劑量依賴性。ABCA1/G1介導細胞內膽固醇分別轉運至成熟HDL-C顆粒、APOA1和未成熟的HDL-C顆粒[22]。研究表明，ABCA1突變會導致丹吉爾病，即嚴重的HDL-C缺乏和全身性動脈粥樣硬化[23]，因此ABCA1/G1在動脈粥樣硬化中具有重要作用。本課題組發現，益氣活血化痰方可以激活ApoE-/-小鼠體內LXRα表達，促使下游SREBP1、ABCA1和ABCG1表達升高，進而影響小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C等脂質水平。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖6 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1/G1蛋白表達Fig.6 Aortic protein expressions of LXRα, SREBP1 and ABCA1/G1 of ApoE-/- mice in each

綜上所述，益氣活血化痰方可通過刺激LXRα表達，調控SREBP1、ABCA1/G1表達，影響膽固醇逆轉運過程，發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

注：與空白對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖7 各組ApoE-/-小鼠主動脈組織中LXRα、SREBP1、ABCA1/G1 mRNA表達Fig.7 Aortic mRNA expressions of LXRα, SREBP1 and ABCA1/G1 in ApoE-/- mice of each