α-常春藤皂苷協同雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞增殖和周期的影響

張夜航， 盧文麗， 彭佩克， 方肇勤

(上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203)

原發性肝癌(以下簡稱肝癌)是世界上第五大常見惡性腫瘤(發病率)，全球每年新發病例約有一半發生在我國[1-2]。越來越多證據表明，在應對惡性腫瘤(如肝癌等擁有復雜病因學和病理生理學特征的疾病)時，聯合/協同療法具有更強的療效優勢，如將多種藥物活性成分聯合，可構成多靶點協同效應，實現對腫瘤細胞的增殖抑制[3-4]。

本課題組長期以來在肝癌臨床辨證論治常用熱解毒、行氣活血、健脾益氣等治則治法的指導下，沿治法-方藥-單味中藥-中藥有效組分-有效組分配伍思路不斷深入，通過大量體內外實驗，逐步篩選出行氣活血治法代表中藥預知子，發現它能有效抑制不同肝癌細胞惡性增殖，其機制包括選擇性誘導癌細胞發生嚴重內質網應激等特殊途徑，并且與遺傳霉素、阿霉素、絲裂霉素、博來霉素等聯用后，存在減量、增效效應[5-15]。最新研究發現，預知子醇提物和雷公藤紅素在抑制肝癌細胞增殖方面存在協同效應[16]，但部分機制仍待闡釋。

預知子提取物中包含多種成分，如α-常春藤皂苷，木通皂苷D，木通皂苷E等[17]，但具體是哪一種或哪幾種發揮了與雷公藤紅素的協同效應尚未明確。鑒于α-常春藤皂苷為藥典中提及的主要成分[18]，本研究初步探索它與雷公藤紅素協同用藥對SMMC7721肝癌細胞增殖和周期的影響。

1 材料

1.1 細胞株 SMMC7721人肝癌細胞株，購自中國科學院上海細胞所，置于完全培養基(10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素+RPMI-1640)中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，每3～4 d傳代1次，取對數生長期者實驗。

1.2 試劑與藥物 α-常春藤皂苷(批號7498)、二甲基亞砜(批號20200509)(國藥集團化學試劑有限公司)；雷公藤紅素(美國Selleck公司，批號S129005)。RPMI-1640培養液、胎牛血清、0.25% 胰酶-EDTA(美國Corning公司，批號28620006、35081004、10519010)；噻唑藍(MTT)(美國Sigma-Aldrich公司，批號MKBH9792V)；PageRulerTM預染蛋白Ladder(美國Thermo Scientific公司，批號00792185)；青霉素-鏈霉素、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠Ig(H+L)、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BeyoECL Plus超敏ECL化學發光試劑盒、一抗稀釋液、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，貨號C0222、A0208、A0216、P0013C、ST506、P0018S、P0023A、P0013C)；細胞FITC-PI細胞凋亡染色試劑盒(天津三箭生物技術股份有限公司，批號AG519)；細胞周期染色試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，批號A00611)；β-actin鼠抗人一抗(美國Affinity Biosciences公司，批號85r7978)；兔抗人一抗CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin A1/2、Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1(英國Abcam公司，批號GR3282664-3、GR3302404-8、GR3293297-3、GR3233421-7、GR211873-6、GR3256653-4、GR3233421-7、GR156113-14)。

1.3 儀器 CP2250型電子分析天平(德國Sartorus公司)；MH-1型搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)； Model 310型二氧化碳培養箱、1300 SERIES A2型生物安全柜、HPS RT2 Advanced型加熱磁力攪拌器(美國Thermo Scientific公司)；ELX-800型全自動酶標儀(美國Bio-Tek公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司重慶光學儀器廠)；PowerPacTMBasic型電泳儀及配套電泳槽、170-3930型小型濕轉槽(美國Bio-Rad公司)；FluorChem E型化學發光高靈敏度凝膠成像與分析系統(美國Protein-Simple公司)；564A CytoFLEX S型流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞存活率 將細胞接種于96孔板中，當其生長至30%～40%時加入不同質量濃度α-常春藤皂苷(20.0、10.0、5.0、2.5、0.5、0.1、0.01 μg/mL)、雷公藤紅素(1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.01 μg/mL)，另設對照組(有細胞，但無藥物干預)，每組8個復孔，分別在24、48、72 h進行MTT 檢測，吸棄原培養液，每孔加入200 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h，吸棄MTT溶液，加入150 μL DMSO溶液，避光振搖10 min，采用全自動酶標儀在570 nm波長處檢測吸光度(A)，計算細胞存活率，公式為存活率=[(A用藥組-A空白孔)/(A空白組-A空白孔)]×100%，至少重復3次。

2.2 聯合指數(CI)值測定 依據MTT數據，α-常春藤皂苷質量濃度選擇10.0、5.0、1.0、0.1 μg/mL，雷公藤紅素質量濃度選擇0.30、0.15、0.03 μg/mL，排列組合后共12個聯合用藥組，分別為10.0 μg/mL+0.30 μg/mL、10.0 μg/mL+0.15 μg/mL、10.0 μg/mL+0.03 μg/mL、5.0 μg/mL+0.30 μg/mL、5.0 μg/mL+0.15 μg/mL、5.0 μg/mL+0.03 μg/mL、1.0 μg/mL+0.30 μg/mL、1.0 μg/mL+0.15 μg/mL、1.0 μg/mL+0.03 μg/mL、0.1 μg/mL+0.30 μg/mL、0.1 μg/mL+0.15 μg/mL、0.1 μg/mL+0.03 μg/mL，計算細胞抑制率，公式為抑制率=[1-(A用藥組-A空白孔)/(A空白組-A空白孔)]×100%。依據Chou-Talalay原理，將各單藥及各聯合組的質量濃度及抑制率輸入CompuSyn 1.0軟件(www.combosyn.com)[19-20]，可自動計算CI值，其數值<1、=1、>1分別表示協同作用、加性效應、拮抗作用，計算公式為CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2，其中(Dx)是單獨抑制x%的藥物1或2的劑量，(D)是組合抑制x%的藥物1或2的劑量，故(D)1+(D)2是組合抑制x%，至少重復3次。

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染色法結合流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞隨機分為對照組、α-常春藤皂苷(10.0 μg/mL α-常春藤皂苷)、雷公藤紅素(0.30 μg/mL雷公藤紅素)、協同組(10.0 μg/mL α-常春藤皂苷+0.30 μg/mL雷公藤紅素)，給予相應藥物處理48 h，收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，1×結合緩沖液洗滌細胞1次后重懸，調整密度至1×106～5×106/mL，每管流式管加入100 μL細胞懸液、5 μL Annexin V-FITC(PI單染及雙陰組除外)，室溫避光孵育15 min，加入3 μL PI(Annexin V-FITC單染和雙陰組除外)，室溫避光孵育10 min，每管加入400 μL預冷的PBS，在2 h內上機檢測完畢。數據采用FlowJo VX軟件進行分析。

2.4 流式PI單染法結合流式細胞術檢測細胞周期分布 收集各組細胞至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL預冷PBS重懸細胞，并轉移至1.5 mL離心管，離心1次后棄上清，輕彈管底以適當分散細胞，緩慢加入1.0 mL預冷的無水乙醇，輕輕吸打混勻，在4 ℃下固定過夜，1 000 r/min離心5 min，棄上清，輕彈管壁使沉淀松散，加入1 mL PBS，靜置5 min，離心后棄上清，每管加入1 mL染色液，渦旋振蕩5 s混勻，轉入流式管，室溫避光孵育30 min，將樣本置于冰上送檢，當日內完成檢測。采用NovoExpress軟件進行數據分析。

2.5 Western blot法檢測相關蛋白表達 收集各組細胞，RIPR裂解液[含50 mmol/L Tris(pH 7.4)、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS]裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液檢測蛋白濃度，上樣量20～30 μg，10% SDS-PAGE膠電泳，轉移蛋白至0.45 μm PVDF膜上，5% BSA室溫封閉2 h，加入一抗CDK1(1∶20 000)、CDK2(1∶5 000)、CDK4(1∶5 000)、CDK6(1∶5 000)、Cyclin A1/2(1∶1 000)、Cyclin B1(1∶50 000)、Cyclin D1(1∶20 000)、Cyclin E1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，BeyoECL顯色后采用成像與分析系統獲得條帶，以β-actin為內參。采用Image J圖像軟件進行灰度值計算。

3 結果

3.1 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細胞不同時間點存活率的影響 如圖1所示，隨著α-常春藤皂苷、雷公藤紅素質量濃度增加，細胞存活率均呈降低趨勢；與對照組比較，2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL α-常春藤皂苷和0.2、0.4、0.8、1.6 μg/mL雷公藤紅素分別作用24、48、72 h后，細胞存活率均降低(P<0.05)；0.1 μg/mL雷公藤紅素作用24、48 h后，細胞存活率均低于對照組(P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖1 α-常春藤皂苷(A)、雷公藤紅素(B)對SMMC7721細胞不同時間點存活率的影響Fig.1 Effects of α-hederin(A) and orcelastrol(B) on survival rates of SMMC7721 cells at different time

3.2 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細胞增殖抑制效應及聯合指數CI值 如表1、圖2所示，作用48 h后，當α-常春藤皂苷質量濃度為10.0 μg/mL，雷公藤紅素質量濃度為0.30 μg/mL時，CI值最低，即具有最強的協同效應，故選擇上述條件開展后續研究。

表1 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細胞增殖抑制效應及CI值Tab.1 Inhibitory effects of α-hederin and celastrol on SMMC7721 cell proliferation and CI values

3.3 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞凋亡的影響 如圖3A、表2所示，協同組SMMC7721細胞早期凋亡率高于對照組和單獨給藥組(P<0.05)；與對照組比較，α-常春藤皂苷組、協同組SMMC7721細胞晚期凋亡率和總凋亡率均升高(P<0.05)。

3.4 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞周期分布的影響 如圖3B、表3所示，與對照組比較，雷公藤紅素組、協同組SMMC7721細胞G0/G1期比例、G1+S期總比例均升高(P<0.05)，G2/M期比例均降低(P<0.05)；與對照組比較，α-常春藤皂苷組SMMC7721細胞S期比例升高(P<0.05)，雷公藤紅素組、協同組SMMC7721細胞S期比例無明顯變化(P>0.05)。

首先，可能是一種素養的養成。不管是在自己家里成天找東西的人，還是那個險些命喪自己丟在床上的西瓜刀的孩子，他們并無害人之心，更無傷己之意。他們之所以沒有養成將用完的東西放回原處這樣簡單的生活習慣，多半是因為自小沒有受到這樣的家庭教育和熏陶，也就沒有在心里固化這樣的意識。他們的父母，也沒有認識到這樣的家庭教養的重要性；或者，他們的父母自身，也缺乏這樣的素養。

表3 各組SMMC7721細胞周期分布Tab.3 Cell cycle distribution of SMMC7721 cells in each

注：Fa為細胞增殖抑制效果水平。A為量效曲線圖，B為CI值-Fa曲線圖。圖2 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721細胞增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of α-hederin and celastrol on SMMC7721 cell proliferation

圖3 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞凋亡和細胞周期分布的影響Fig.3 Effects of α-hederin and celastrol on apoptosis and periodic distribution of SMMC7721 cells

表2 各組SMMC7721細胞早期、晚期及總凋亡率Tab.2 Early, late and total apoptotic rates of SMMC7721 cells in each

3.5 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響 如圖4A、4G所示，與對照組比較，α-常春藤皂苷組、雷公藤紅素組SMMC7721細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達呈升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與α-常春藤皂苷組比較，協同組SMMC7721細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)；各組SMMC7721細胞Bax/Bcl2值比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05；與α-常春藤皂苷組比較，#P<0.05；與雷公藤紅素組比較，▲P<0.05。圖4 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞凋亡和周期相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of α-hederin and celastrol on apoptosis and cell cycle-related protein expressions of SMMC7721

3.6 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞CDKs表達的影響 如圖4B～4F、4H所示，與對照組比較，α-常春藤皂苷組、雷公藤紅素組SMMC7721細胞中CDK2、CDK4蛋白表達均無明顯變化(P>0.05)，但協同組SMMC7721細胞中CDK2、CDK4蛋白表達均降低(P<0.05)，并且低于各單獨給藥組(P<0.05)；各組SMMC7721細胞CDK1、CDK6蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

3.7 α-常春藤皂苷、雷公藤紅素對SMMC7721肝癌細胞Cyclins表達的影響 如圖4B～4F、4I所示，與對照組比較，各給藥組SMMC7721細胞中Cyclin E1蛋白表達均升高(P<0.05)，但各給藥組之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；雷公藤紅素組、協同組SMMC7721細胞中Cyclin D1蛋白表達均升高(P<0.05)，以協同組更明顯(P<0.05)；協同組中Cyclin A1/2表達低于雷公藤紅素組(P<0.05)；CyclinB1蛋白表達比較，組間差異無統計學意義(P>0.05)。

4 討論

國內外研究結果顯示，甘草次酸、紫杉醇、大黃酸均可增強雷公藤紅素對HepG2細胞增殖抑制作用，而且在低質量濃度時作用更明顯[21]；與雷公藤甲素聯用時，可使人非小細胞肺癌H1299、H157細胞G2/M期周期阻滯[22]；與索拉非尼聯用時，在體內外均能增強它對癌細胞的生長抑制和凋亡誘導作用，并降低用量[23]；可增強拉帕替尼的細胞毒性和促凋亡能力[24]。α-常春藤皂苷與紫杉醇聯用時，在抑制非小細胞肺癌細胞增殖、促進凋亡方面具備協同作用[25]；與5-FU聯用時，在中等細胞毒性范圍對HT-29結腸癌細胞增殖抑制顯示出協同效應，增強結腸癌細胞敏感性[26]。

本研究發現，當α-常春藤皂苷質量濃度為10.0 μg/mL，雷公藤紅素質量濃度為0.30 μg/mL時，具有較好的協同效應，以作用48 h更明顯；在早期凋亡中，協同組凋亡率較其他組均升高，而晚期凋亡和總凋亡表現出類似的現象，即α-常春藤皂苷和協同組凋亡率均高于對照組，并以協同組更明顯。但在上述質量濃度下，單獨給藥、協同作用所誘發的凋亡現象并不嚴重，后續針對在肝癌細胞凋亡中被視為具有重要調控作用的經典分子(如Bax、Bcl-2等)開展的研究也印證了這一點[27]，即誘發凋亡可能并不是兩者協同效應產生的主要原因。為進一步明確其機制，有必要繼續觀察對細胞周期分布的影響。

前期關于α-常春藤皂苷或雷公藤紅素致不同細胞周期阻滯也有相關報道，但結果無一致性，如前者可誘導SKOV-3人卵巢癌細胞發生G0/G1期細胞周期阻滯[28]，誘導SW620人結腸癌細胞出現G2/M期周期阻滯[29]；后者可致鼻咽癌NPC細胞G2/M期周期阻滯[30]，致骨肉瘤HOS和MG-63細胞G2/M期周期阻滯[31]。本研究發現，α-常春藤皂苷作用后細胞周期S期比例升高；雷公藤紅素可引起G0/G1期周期阻滯；兩者協同作用后，可使細胞周期分布中G1+S期總比例進一步被提升，同時也提示其作用機制的差異。

為進一步揭示周期阻滯分子機制，本研究一方面圍繞細胞由G1向S期轉變檢測點周期蛋白相關分子，即CDKs如CDK2、CDK4和CDK6，Cyclins如Cyclin D1和Cyclin E1開展了檢測，發現協同組CDK2、CDK4表達均降低，而Cyclin D1、Cyclin E1表達升高，推測可能由于CDK2、CDK4表達降低影響了CDK4/6-Cyclin D、CDK2-Cyclin E復合物的形成，從而使細胞阻滯于G0/G1期，另外Cyclin D1的變化趨勢與各組周期阻滯效果的差異較為對應，推測可能是參與其中的關鍵分子，具體仍需進一步驗證；另一方面，α-常春藤皂苷作用后細胞周期S期比例也出現了小幅度升高，故嘗試對Cyclin A1/2和Cyclin B1開展了觀察，但未發現特殊變化，可能與其質量濃度較低有關。

綜上所述，本研究明確了α-常春藤皂苷、雷公藤紅素協同抑制SMMC7721肝癌細胞增殖作用，兩者雖然可致細胞凋亡現象增加，但主要與誘導G0/G1期周期阻滯、進一步提升G1+S期總比例有關，而且Cyclin D1可能是參與其中的關鍵分子。