黃連中1個新型生物堿的研究

孫 雨， 蘇本正， 蔣海強， 王 珺， 于宗淵*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

黃連CoptischinensisFranch為毛茛科黃連屬植物，主產于四川峨眉、洪雅、彭州，重慶石柱、巫山，湖北利川等地[1]，在歷代本草《名醫別錄》《唐本草》《本草綱目》中均有記載[2]，其中峨眉是道地主產區，其味苦性寒，無毒，歸心、肝、胃、大腸經，具有清熱解毒、止血涼血的功效[3]，具有多種藥理活性，主要為抗菌[4]、抗炎、抗氧化[5]、降壓及擴張血管、舒張平滑肌[6]、保護胃黏膜[7]、保護中樞神經細胞[8]、調血脂[9]、降血糖等[10-11]，具有較高的藥用和保健價值[12-13]。目前，從黃連屬植物中發現的生物堿均為異喹啉類生物堿，絕大多數為芐基異喹啉類，包括原小檗堿類、雙芐基異喹啉類、阿樸菲類、苯菲啶類等，其中原小檗堿類又包括原小檗堿型、氧化原小檗堿型、甲基原小檗堿型、四氫原小檗堿型等，以季銨型生物堿為主[14]。大量研究表明，生物堿是黃連主要有效成分[15]，現已從中發現了四十多種，其中小檗堿、黃連堿、表小檗堿、巴馬汀、藥根堿在黃連總生物堿中的占比高達70%～80%，除此之外還含有木脂素、香豆素、黃酮、萜類、甾體、有機酸、揮發油、多糖等多種成分[16]。為深入探究黃連藥理活性的物質基礎，本實驗對其化學成分進行了系統研究，通過1H-NMR、13C-NMR等波譜技術和從相近的極性環境中分離得到3個化合物，其中，化合物1為未見文獻報道的新型芐基異喹啉生物堿，結構見圖1。

圖1 化合物1結構Fig.1 Structure of compound 1

1 材料

VANCE III-600型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；UV3000型紫外光譜測定儀(日本日立公司)；NEXUS 670 FT-IR型紅外光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Agilent 1260型高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜(HPLC-Q-TOF-MS)(美國Agilent公司)；半制備色譜柱ODS-2(20 mm×250 mm, 5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；N-1100型旋轉蒸發儀、CCA-1112A型低溫冷卻液循環泵(上海愛朗儀器有限公司)；Bio-Rad SHZ-DⅢ型循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；VG AutoSPE-3000光譜儀(德國斯派克分析儀器公司)；HP-Q-UV100型高壓制備液相色譜儀(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

薄層色譜硅膠GF254(100 mm×100 mm)、柱色譜用硅膠(100～200、200～300目)(青島海洋化工有限公司)。98%硫酸(重慶川東化工有限公司)；甲醇、乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

黃連于2018年購自山東省濟南百味堂中藥飲片公司(批號180506)，經山東中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定為毛茛科黃連屬黃連CoptischinensisFranch的根莖，樣品保存放于山東中醫藥大學藥學院藥物化學實驗室。

2 提取與分離

取黃連干燥根莖10 kg，75%乙醇室溫浸漬提取3次，每次8 d，提取液過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，依次用石油醚(3×5 L)、二氯甲烷(3×5 L)、乙酸乙酯(3×5 L)、正丁醇(3×5 L)萃取，減壓濃縮得二氯甲烷萃取物33.6 g，經硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯梯度)洗脫，分離得到3個流分Fr.1～Fr.3。Fr.1經半制備HPLC(甲醇-水)洗脫，得到化合物1、2、3。

3 結構鑒定

在1H-NMR譜中，低場區有3組芳香氫的質子信號[δH8.37(1H, d,J=5.4 Hz, H-3)，7.86(1H, d,J=5.4 Hz, H-4)；7.49(1H, s, H-5)，7.38(1H, s, H-8)；7.31(1H, d,J=8.4 Hz, H-6′)，7.18(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)]、1個亞甲二氧基質子信號[δH6.24(2H, s)]，中場區給出1個連氧亞甲基質子信號[δH4.09(2H, q,J=7.2 Hz, COOCH2CH3)]，高場區給出1個甲基質子信號[δH1.18(3H, t,J=7.2 Hz, COOCH2CH3)]、2個甲氧基質子信號[δH3.92(3H, s, 4′-OCH3)，3.78(3H, s, 3′-OCH3)]。在13C-NMR譜中有22個碳信號，包括2個羰基碳信號[δC193.2(CO),δC166.1(C-1″)]、1組異喹啉碳信號[δC152.9(C-1)，150.9(C-7)，149.5(C-6)，140.3(C-5)，135.2(C-4a)，123.0(C-8a)，122.6(C-4)，112.8(C-8)，102.9(C-3)；156.6(C-4′)，145.7(C-3′)，129.9(C-2′)，129.6(C-5′)，127.8(C-1′)，100.6(C-6′)]、1個亞甲二氧基信號(δC102.4)、1個亞甲基碳信號[δC61.0(C-2″)]、2個甲氧基碳信號[δC61.3(3′-OCH3)，56.4(4′-OCH3)]、1個甲基碳信號[δC13.8(C-3″)]，通過數據分析和文獻比對，推測化合物1可能為生物堿[17]，再通過 HSQC譜進一步將其1H-NMR、13C-NMR數據予以歸屬，見表1。

表1 化合物1的1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)和13C-NMR數據(150 MHz, DMSO-d6)Tab.1 1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6) and 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) data on compound 1

根據1H-1H COSY譜可知，H-3(1H, d,J=5.4 Hz)與H-4(1H, d,J=5.4 Hz)相耦合，結合HMBC譜(圖2)中H-3與C-1(δ152.9)、C-4(δ122.6)、C-4a(δ135.2)相關，H-4與C-3(δ102.9)、C-5(δ140.3)、C-8a(δ123.0)相關，H-5(δ7.49, s)與C-6(δ149.5)、C-8a相關，H-8(δ7.38, s)與C-1、C-7(δ150.9)、C-4a相關，表明存在1個喹啉單元。結合碳譜、氫譜、HMBC譜中C-6、C-7的δC102.4、δH6.24(2H, s)發現，兩者有1個亞甲二氧基與喹啉單元相連；根據C-1′(δ127.8)、C-2′(δ129.9)、C-3′(δ145.7)、C-4′(δ156.6)、C-5′(δ129.6)、C-6′(δ100.6)、H-5′(1H, d,J=8.4 Hz)、H-6′(1H, d,J=8.4 Hz)位移值，并結合HMBC譜中H-5′與C-1′、C-3′、C-4′、C-6′相關，H-6′與C-2′、C-5′、-CO-相耦合，提示存在1個1′,2′,3′,4′-4取代的苯環；δC193.2位于低場區，說明存在1個羰基，而且H-6′與其遠程相關,說明羰基連在苯環的C1′位，同時羰基為強吸電子基團，會使相連C的化學位移值升高；在異喹啉環上，C1的化學位移值達到了152.9，在DEPT 135譜圖中也沒有發現化學位移值為152.9的碳，說明C1與羰基碳相連；在1H-NMR中存在化學位移值為3.92、3.78的2個單峰，表明存在2個甲氧基，HMBC譜中4′-OCH3(δ3.92)與C-4′相關，3′-OCH3(δ3.78)與C-3′相關，說明3′-OCH3、4′-OCH3分別與苯環上的C3′、C4′位相連；δH7.31、7.18的耦合常數為8.6 Hz，說明這2個氫處于鄰位，而且δH7.31與C-6′直接相關，δH7.18與C-5′直接相關，表明δH7.31、δH7.18分別為C-6′、C-5′上的氫。H-2″(2H, q,J=7.2 Hz)與C-1″(δ166.1)、C-3″(δ13.8)相耦合，H-3″(3H, t,J=7.2 Hz)與C-2″(δ61.0)相耦合，H-2″與C-1″遠程相關，說明存在1個-COOCH2CH3片段連在苯環的C2′位；C-1位移值表明異喹啉單元與1′,2′,3′,4′-4取代的苯環通過-CO-相連。綜上所述，化合物1為1個新型異喹啉類生物堿，命名為6-([1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinoline-5-carbonyl)-2,3-dimethoxybenzoic acid ethyl ester。

圖2 化合物1的主要HMBC和1H-1H COSY相關Fig.2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z: 205.2[M+H]+,分子式C11H11NO3。1H-NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ:7.28(1H, s, H-8), 6.85(1H, s, H-5), 6.05(2H, s, -OCH2O-), 3.48(2H, t,J=6.6 Hz, H2-3), 2.98(3H, s, N-CH3), 2.86(2H, t,J=6.6 Hz, H2-4);13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:163.2(C-1), 47.4(C-3), 27.2(C-4), 123.0(C-4a), 106.8(C-5), 149.8(C-6), 146.2(C-7), 107.2(C-8), 134.1(C-8a), 34.5(N-CH3), 101.5(-OCH2O-)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定為oxohydrastinine。

化合物3：白色粉末，EI-MSm/z: 358.4[M]+，分子式C20H22O6。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.88(2H, s, H-2′, 2″)，6.75(2H, dd,J=9.0 Hz, H-6′, 6″)，6.72(2H, d,J=9.0 Hz, H-5′, 5″)，4.60(2H, d,J=4.2 Hz, H-2, 6)，4.11(4H, m, H-4, 8)，3.76(6H, s, -OCH3×2)，3.03(2H, m, H-1,5)；13C-NMR(150 MHz, DMSO-d6)δ:147.5(C-3′,3″), 146.0(C-4′,4″)，132.2(C-1′,1″)，118.7(C-6′,6″)，115.2(C-5′,5″)，110.4(C-2′,2″)，85.2(C-2,6)，70.9(C-4,8)，55.6(-OCH3×2)，53.6(C-1,5)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定為pinoresinol。

4 討論

黃連是一種極具特色的傳統中藥，中醫臨床上常用來清熱解毒、預防上火、消炎殺菌，也常與其他中藥組成復方來治療各種疾病。本實驗對黃連化學成分進行研究，采用多種分離純化技術和鑒定手段，從其75%乙醇提取物的二氯甲烷部位中發現3個化合物，包括1個新型異喹啉類生物堿，可為該藥材藥效物質基礎的研究提供依據，也為其深入開發利用奠定基礎，但上述成分的具體活性尚不明確，還需進一步考察。