大黃酸結(jié)腸靶向微丸包衣處方的篩選及其釋藥性能評(píng)價(jià)

江蕾蕾， 王秀敏， 江昌照， 馬 瑞， 葉金翠

(浙江省神經(jīng)精神疾病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，浙江 杭州 310013)

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性非特異性炎癥腸病，其病因復(fù)雜，發(fā)病率高[1]，癌變幾率大，被世界衛(wèi)生組織稱為“不是癌癥的癌癥”[2]，對(duì)患者日常生活造成極大的困擾。臨床研究表明，大黃復(fù)方湯劑[3-5]、單味藥[6]及其有效成分[7](蒽醌類、多糖類)在潰瘍性結(jié)腸炎的防治上均具有一定作用，大黃酸作為該藥材活性成分之一，具有顯著的抗炎[8]、抗腫瘤[9]、調(diào)節(jié)腸道菌群[10]等活性，還可治療DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎[11]，同時(shí)它在全腸段均有較好的吸收[12]。

由于潰瘍性結(jié)腸炎的病灶主要在結(jié)腸，故將藥物準(zhǔn)確遞送到病變部位、延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間是未來治療的關(guān)鍵，但目前臨床上大黃相關(guān)制劑主要為湯劑、灌腸劑、傳統(tǒng)口服制劑等，缺少一定結(jié)腸靶向性。因此，本實(shí)驗(yàn)以胃腸道pH的差異[13]為基礎(chǔ)，大黃酸為模型藥，構(gòu)建一種能使藥物順利經(jīng)過胃和小腸、在到達(dá)結(jié)腸部位后才開始釋放的口服結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)，這不僅將突破該成分在治療潰瘍性結(jié)腸炎上的制劑空白，也可為相關(guān)治療和制劑開發(fā)提供一定的思路和參考。

1 材料

1.1 儀器 XS205、TG328A電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Agilent 1200 series高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；E-50擠出機(jī)、S-250滾圓機(jī)(Enger英格造粒包衣技術(shù)有限公司)；UDT-804-8溶出試驗(yàn)儀[祿亙儀器設(shè)備(上海)有限公司]；Mini型流化床包衣機(jī)(沈陽(yáng)醫(yī)聯(lián)新藥研究所)。

1.2 試劑與藥物 大黃酸原料藥(純度>98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)20181012)；大黃酸對(duì)照品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)Y12D3Y)。聚丙烯酸樹脂(安徽天然制藥有限公司，批號(hào)180207；德國(guó)羅姆公司，批號(hào)B180106202)；微晶纖維素、乳糖(鄭州博研生物科技有限公司)；檸檬酸三乙酯(西安泰華醫(yī)藥科技有限公司)。

2 方法

2.1 微丸制備 將藥物與輔料(大黃酸、MCC、乳糖比例2∶4∶1)混合均勻后過80目篩，加入適量潤(rùn)濕劑(超純水)制軟材。采用擠出滾圓技術(shù)，先在擠出機(jī)中以一定速度擠出條狀物，再于滾圓機(jī)中以一定速度滾圓若干分鐘形成微丸，最后在60 ℃烘箱中烘干2 h，過18～24目篩，即得。

2.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 圓整度測(cè)定 將一定量微丸平鋪于玻璃平板上，將平板一側(cè)抬起，測(cè)定在小丸開始滾動(dòng)前傾斜平面與水平面所形成的角(Φ)。Φ越小，表明圓整度越好。

2.2.2 堆密度測(cè)定 稱取一定量微丸(m)，置于10 mL量筒中，從距離桌面2 cm處下落，連續(xù)操作3次，測(cè)定其體積(V)，計(jì)算堆密度(d)，公式為d=m/V。

2.2.3 脆碎度測(cè)定 稱取5 g微丸放入脆碎度檢查儀，振蕩5 min后取出，40目篩篩分，稱量留在篩網(wǎng)上的微丸質(zhì)量(W)，計(jì)算脆碎度(Fr)，公式為Fr=(5-W)/W。

2.3 包衣液制備 取適量丙烯酸樹脂(L100、S100)至一定體積95%乙醇中，充分溶脹后加入20%檸檬酸三乙酯作為增塑劑，15%滑石粉作為抗粘劑，攪拌過夜過180目篩，即得。

2.4 包衣方法、包衣參數(shù)確定 采用mini型流化床進(jìn)行包衣，恒流泵輸入包衣液，在包衣完成后于適宜物料溫度下再干燥3 min。包衣參數(shù)為底噴包衣；體積流量0.5～0.8 mL/min；物料溫度32～37 ℃；流化量25 m3/h；噴霧壓力1.0～1.2 bar(1 bar=100 kPa)；進(jìn)口溫度45～50 ℃。

2.5 溶出介質(zhì)制備 按照2015年版《中國(guó)藥典》四部方法制備。

2.5.1 人工胃液(pH1.2) 量取16.4 mL稀鹽酸，超純水定容至1 000 mL，充分混勻，即得(稀鹽酸配制方法為取鹽酸234 mL，加水至1 000 mL，混勻，即得)。

2.5.2 人工腸液(pH6.8) 取0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液250 mL，加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液118 mL，加水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得。

2.5.3 人工結(jié)腸液(pH7.6) 稱取磷酸二氫鉀27.22 g，加水溶解至1 000 mL，取50 mL，加0.2 mol/L氫氧化鈉溶液42.4 mL，再加水稀釋至200 mL，即得。

2.6 釋放度測(cè)定 取包衣微丸(大黃酸含量約為18.2%)約0.5 g，直接置于轉(zhuǎn)籃中，平行3份。按照2020年版《中國(guó)藥典》四部0931溶出度與釋放度測(cè)定法第一法(轉(zhuǎn)籃法)，溶出介質(zhì)為人工胃液、人工小腸液、人工結(jié)腸液各900 mL，設(shè)定溫度為(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min，先置于人工胃液中2 h，并于2 h末升起轉(zhuǎn)籃，再置于37 ℃保溫的人工小腸液中3 h，最后置于37 ℃保溫的人工結(jié)腸液中7 h，于0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12 h各取樣2.5 mL，同時(shí)向溶出液中注入2.5 mL相應(yīng)溶出介質(zhì)。根據(jù)前期建立的溶出度含量測(cè)定方法測(cè)定大黃酸含量，計(jì)算平均累積釋放度。

2.7 色譜條件 Kromascil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸(85∶15)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)432 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.8 線性關(guān)系考察 取31.1 μg/mL對(duì)照品溶液0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL至5 mL量瓶中，82.8 μg/mL對(duì)照品溶液4、3、2、1、0.5、0.25 mL至5 mL量瓶中，103.8 μg/mL對(duì)照品溶液4、2、1、0.5、0.2、0.1 mL至5 mL量瓶中，分別以pH1.2、6.8、7.6的溶出介質(zhì)定容至刻度，分別精密吸取10 μL，在“2.7”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程分別為人工胃液Y=21.677X+4.326 7(r=0.996 4)，線性范圍0.62～3.73 μg/mL；人工小腸液Y=43.343X-18.38(r=0.999 1)，線性范圍4.14～66.24 μg/mL；人工結(jié)腸液Y=42.195X-98.134(r=0.999 1)，線性范圍2.07～83.04 μg/mL。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)量評(píng)價(jià) 表1顯示，丸芯的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

表1 大黃酸丸芯質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

3.2 處方篩選I 以pH依賴型材料Eudragit S100、L100為成膜劑，根據(jù)前期文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按表2處方安排，對(duì)大黃酸丸芯進(jìn)行包衣，按“2.3”項(xiàng)下方法配制包衣液，設(shè)定包衣增重25%，按“2.7”項(xiàng)下方法測(cè)定結(jié)腸靶向釋藥性能。結(jié)果，當(dāng)Eudragit S100用量逐漸增加時(shí)，在人工胃液、小腸液中的泄露藥物量降低，而在人工結(jié)腸液中的釋放藥物量升高，這是因?yàn)镋udragit L100的pH達(dá)到6.5時(shí)，外膜就開始溶蝕，而Eudragit S100的pH一般在7以上時(shí)才開始溶蝕，同時(shí)隨著Eudragit L100的加入，包衣膜通透性較好。雖然Eudragit S100用量越高，處方總體釋放度越低，但為了減少有效成分在胃、小腸段中的泄露量，并結(jié)合包衣微丸的通透性，本實(shí)驗(yàn)以Eudragit S100與L100 4∶1的比例繼續(xù)開展后續(xù)試驗(yàn)。

表2 pH敏感層包衣處方

3.3 處方篩選Ⅱ 以pH依賴型材料Eudragit S100、L100為成膜劑，確定兩者比例為4∶1，用量為10 g，選擇檸檬酸三乙酯作為增塑劑，滑石粉作為抗粘劑，采用L4(23)正交設(shè)計(jì)表，以增塑劑、抗粘劑用量為影響因素，擬定表3包衣液處方，按“2.2”項(xiàng)下方法制備包衣液，包衣增重25%，按“2.6”項(xiàng)下方法測(cè)定釋放度，進(jìn)行綜合評(píng)分，計(jì)算公式為綜合評(píng)分=人工結(jié)腸液釋放率-人工小腸液釋放率-人工胃液釋放率，結(jié)果見表4～5。由此可知，以處方3包衣時(shí)，微丸在胃液、小腸液中的藥物泄漏較少，而在結(jié)腸液中釋放較高，即結(jié)腸靶向釋藥性能較優(yōu)，可能與增塑劑用量有關(guān)，可使包衣膜更加致密完整，從而較好地防止藥物泄露。

表3 pH敏感層包衣處方

表4 pH敏感層包衣處方體外釋放度測(cè)定結(jié)果

表5 方差分析

3.4 包衣層厚度考察 按“2.3”項(xiàng)下方法制備包衣液，按“2.4”項(xiàng)下方法包衣，使丸芯分別增重15%、25%、35%、45%，按“2.7”項(xiàng)下方法測(cè)定體外釋放度，結(jié)果見表6。由此可知，增重25%時(shí)即可顯著減少藥物在胃、小腸液中的泄漏量，而且在結(jié)腸液中能較完全地釋藥，但如果包衣層厚度太大，則會(huì)明顯影響藥物在結(jié)腸液中釋放的完全性，最終選擇包衣增重為25%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表6 pH敏感層包衣增重體外釋放度測(cè)定結(jié)果

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 以Eudragit S100-Eudragit L100(4∶1)為膜控材料，增塑劑、抗粘劑用量均為20%，按“2.3”項(xiàng)下方法制備包衣液，按“2.4”項(xiàng)下方法包衣，使包衣增重達(dá)25%，制備3批大黃酸包衣微丸，按“2.7”項(xiàng)下方法測(cè)定體外釋放度，采用f2相似因子法評(píng)價(jià)其一致性。結(jié)果見表7～9、圖1。由此可知，3批小丸f2均>50，表明釋藥具有一致性，不同工藝、批次樣品之間差異較小，并與一級(jí)釋藥模型的相關(guān)性最好，表明其機(jī)制以單純擴(kuò)散為主。

表7 大黃酸結(jié)腸靶向微丸體外釋放度測(cè)定結(jié)果

表8 大黃酸結(jié)腸靶向微丸體外釋放模型擬合結(jié)果

表9 大黃酸結(jié)腸靶向微丸釋放擬合f2測(cè)定結(jié)果

圖1 3批大黃酸結(jié)腸靶向微丸體外釋放曲線

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過擠出滾圓-流化床包衣法制備了pH敏感型的大黃酸結(jié)腸靶向微丸，并以其體外釋放結(jié)果(結(jié)腸靶向性能)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選了pH敏感層包衣的處方和包衣厚度，并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。最終確定，最優(yōu)處方為成膜劑EudragitS100與EudragitL100比例4∶1(德國(guó)羅姆公司)，增塑劑檸檬酸三乙酯用量20%，抗粘劑滑石粉用量20%，溶劑95%乙醇，配制包衣液，包衣使丸芯增重25%，在人工胃液、小腸液中大黃酸的累積泄漏率技能不足10%，而在人工結(jié)腸液中其累積釋放度達(dá)90%以上，并具有良好的結(jié)腸靶向性能，值得進(jìn)一步研發(fā)。

然而，本實(shí)驗(yàn)研制的結(jié)腸靶向微丸仍無法避免在小腸段的泄露，增加包衣膜厚度雖然能有效阻止這一現(xiàn)象，但又會(huì)影響結(jié)腸段釋放。因此，后續(xù)將繼續(xù)尋找新的pH敏感型材料或進(jìn)一步優(yōu)化處方，也適當(dāng)參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行酶促、時(shí)滯、pH敏感雙層包衣手段。