不同化皮、濃縮工藝對阿膠中核苷、氨基酸的影響

齊曉丹， 劉海濱， 牛偉霞， 高登鋒， 王延濤， 王春艷,3， 李 麗,2，張 淹*

(1.東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201；2.山東省膠類中藥技術創新中心，山東 聊城 252201；3.山東省膠類中藥研究與開發重點實驗室，山東 聊城 252201)

阿膠為馬科動物驢EquusasinusL.的皮經去毛、化皮、濃縮等制備工藝，并加入冰糖、豆油等輔料后在高溫下長時間煉制而成的傳統補益類膠類中藥，具有補血滋陰，潤燥、止血等功效[1]，蛋白質含量約占其總量60%～85%，主要包括驢血清白蛋白[2]、核苷、微量元素、糖胺聚糖等[3-4]。近年來，對阿膠成分的研究主要集中在含量較高的蛋白質上，大多數學者認為阿膠發揮療效的主要成分是膠原蛋白，2020年版《中國藥典》也繼續保留了其主要組成氨基酸的含量測定方法。但實際上阿膠是驢皮經化皮、濃縮、煉膠等長時間高溫過程中逐漸降解后形成的復雜多元體系[5]，不同廠家阿膠生產工藝及輔料均存在一定差異，導致其所含成分含量、分子質量分布、物理性狀等均有較大區別，故僅依據氨基酸含量來對阿膠生產工藝的合理性或優化進行精準評價仍具有局限性。

核苷作為維持生物生命活動的基本組成單元，在DNA代謝過程中扮演著重要角色，并且參與體內各種生理過程的調節，表現出多種生物活性，如免疫應答調節、抗血小板凝聚、抗心律失常、抗腫瘤、抗病毒等[6-7]，同時有一些也被證明為動物類藥材的藥效成分[8-10]。因此，本實驗參考文獻[11-14]，測定不同化皮、濃縮工藝中阿膠所含尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷的含量，并與2020年版《中國藥典》收載的氨基酸(L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)含量進行比較，以期客觀評價該藥材生產工藝的合理性和科學性，也為工藝優化和藥材質量標準完善提供參考。

1 材料

Waters型高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA檢測器(美國Waters公司)；MS105型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-800KDE型數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BGZ-246型電熱鼓風干燥箱(上海博迅實業有限公司)。化皮機組(1 m3，山東浩特能源設備有限公司)；WQ-005型單效外循環濃縮器(湖南精誠制藥機械有限公司)。

尿嘧啶(批號100147-20030，純度≥98.0%)、尿苷(批號100147-200302，純度≥98.0%)、胸腺嘧啶(批號10047-200302，純度≥98.0%)、鳥苷(批號111977-201501，純度≥98.0%)、腺苷(批號110879-200202，純度≥98.0%)、L-羥脯氨酸(批號111578-201602，純度99.9%)、甘氨酸(批號140689-202006，純度100.0%)、丙氨酸(批號140680-201604，檢查及含量測定用)、脯氨酸(批號140677-201808，純度99.9%)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。驢皮(5歲驢)由山東天龍牧業有限公司提供，經東阿阿膠股份有限公司牛偉霞副主任中藥師鑒定為馬科動物驢EquusasinusL.的干皮。乙酸銨、甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 制備工藝考察 根據文獻[15-17]報道及實際生產過程中的化皮、濃縮工藝，將驢皮進行泡皮、焯皮后切塊(2 cm×2 cm)混合，取10 kg，按表1條件處理，濃縮至相對密度為1.18(20 ℃)后進行冷凍干燥，平行3次。再采用2020年版《中國藥典》四部通則“0832水分測定法”項下第二法，測定干燥后不同樣品含水量。

表1 阿膠制備工藝條件

2.2 核苷含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷對照品適量，置于100 mL量瓶中，20 mL甲醇溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為0.105、0.176、0.109、0.242、0.287 mg/mL的貯備液，分別精密量取1.0 mL，置于100 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 參考文獻[3,14]報道，精密稱取按表1工藝條件制備的樣品各1.5 g，置于25 mL量瓶中，水浴加熱溶解，冷卻，加水至刻度，搖勻，靜置，精密吸取中層溶液3 mL，置于10 mL量瓶中，精密加入2 mL甲醇，加水定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 色譜條件 Agilent Zorbox SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相1 mmol/L乙酸銨(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～10 min，98%A；10～20 min，98%～95%A；20～35 min，95%～80%A；35～45 min，80%～60% A；45～50 min，60%A)；體積流量0.7 mL/min；檢測波長260 nm[3]。色譜圖見圖1。

1.尿嘧啶 2.尿苷 3.胸腺嘧啶 4.鳥苷 5.腺苷圖1 各核苷HPLC色譜圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于100 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積(Y)對其進樣量(X)進行回歸，結果見表2，可知各核苷在各自范圍內線性關系良好。

表2 各核苷線性關系

2.3.2 精密度試驗 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，測得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷含量RSD分別為0.25%、0.65%、0.65%、0.64%、0.78%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，室溫下于0、1、2、4、6、12 h在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，測得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷峰面積RSD分別為0.15%、1.02%、0.54%、0.68%、0.94%，表明該方法穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，測得尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷含量RSD分別為0.25%、0.65%、0.65%、0.64%、0.78%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 分別精密稱取各核苷含量已知的樣品1.262 9、1.314 5、1.296 8、1.285 7、1.365 4、1.326 4 g，置于25 mL量瓶中，加入對照品溶液(尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷質量濃度分別為5.841 6、8.045 2、21.232 1、9.896 9、9.813 3 μg/mL)5 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，尿嘧啶、尿苷、胸腺嘧啶、鳥苷、腺苷平均加樣回收率分別為100.46%、100.05%、100.14%、99.48%、100.03%，RSD分別為1.52%、1.20%、0.91%、1.04%、1.37%。

2.4 氨基酸含量測定 參照2020年版《中國藥典》一部阿膠項下方法進行測定。

2.4.1 對照品溶液制備 精密稱取L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸對照品適量，0.1 mol/L鹽酸制成每1 mL分別含四者80 μg、0.16 mg、70 μg、0.12 mg的溶液，即得。

2.4.2 供試品溶液制備 取按表1工藝條件制備的阿膠約0.25 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸20 mL，超聲(功率500 W、頻率40 kHz)處理30 min，放冷，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于5 mL安瓿中，加2 mL鹽酸，在150 ℃下水解1 h，放冷，移至蒸發皿中，用10 mL水分次洗滌，洗液并入蒸發皿中，蒸干，殘渣加0.1 mol/L鹽酸溶解，轉移至25 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸至刻度，搖勻，即得。

2.4.3 色譜條件 Agilent Zorbox SB-Aq C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相[乙腈-0.1 mol/L醋酸鈉(醋酸調節pH值至6.5)(7∶93)](A)-[乙腈-水(4∶1)](B)，梯度洗脫，程序見表3；體積流量1 mL/min；柱溫43 ℃；檢測波長254 nm。色譜圖見圖2，理論塔板數按L-羥脯氨酸峰計，應不低于4 000。

表3 梯度洗脫程序

1.L-羥脯氨酸 2.甘氨酸 3.丙氨酸 4.L-脯氨酸圖2 各氨基酸HPLC色譜圖

2.5 數據分析 采用Microsoft Excel 2013軟件處理數據，SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析。

3 結果

表4顯示，高壓化皮-減壓濃縮工藝所制備樣品中各核苷含量高于常壓化皮-常壓濃縮工藝所制備樣品中(P<0.05)；化皮溫度、時間對該類成分含量有明顯影響，而濃縮溫度、時間影響不顯著。另外，4種工藝所制備樣品中各氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)，也無規律性變化。

表4 各核苷、氨基酸含量測定結果(n=3)

4 討論

在2020年版《中國藥典》阿膠“制法”項中，僅簡單描述為“將驢皮浸泡去毛，切塊洗凈，分次水煎，濾過，合并濾液，濃縮(可分別加入適量的黃酒、冰糖及豆油)至稠膏狀，冷凝，切塊，晾干，即得”，而化皮和濃縮工藝[15-17]作為該藥材品質質量等級的關鍵工序之一，對驢皮中驢血清白蛋白、核苷、微量元素、糖胺聚糖等成分的溶出具有至關重要的影響。因此，本實驗探索上述2種工藝對阿膠中核苷、氨基酸含量的影響。

結果顯示，不同化皮工藝不僅是溫度的差異，化皮時間也有所區別，其中高壓化皮工藝溫度高于常壓化皮工藝，但化皮時間明顯更短。為了使不同化皮工藝之間具有可比性，本實驗選擇一致的加水量，發現高壓化皮過程中化皮設備始終處于一個密閉狀態，默認所加溶劑量未變；常壓化皮采用回流裝置，可保證化皮溶劑量與高壓化皮的一致。對于濃縮工藝而言，由于化皮溶劑量的一致也使得化皮液一致，故在濃縮過程中也未添加任何輔料。最終確定，核苷可作為阿膠化皮工藝優化的評價指標。