黃芪與川芎有效成分配伍對乳鼠海馬神經元細胞缺氧缺糖損傷的保護作用

萬浩宇， 杜成昊， 何 昱， 楊潔紅， 丁志山， 周惠芬

(浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053)

缺血性中風已成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病[1-2]，到2030年我國每年新發患者將由現在的180萬例上升至540萬例。黃芪、川芎已成為益氣活血類中醫方劑(如補陽還五湯、腦心通膠囊等)的核心配伍和常用藥對，在中醫臨床上常用于治療腦血管病氣虛血瘀證，臨床療效確切[3-6]。目前，關于黃芪與川芎配伍及其中藥復方的臨床、組分、作用機理等方面已有較多研究[7-8]，但較少涉及其有效成分配伍組合。本實驗選擇黃芪、川芎有效成分黃芪甲苷、藁本內酯、川芎嗪、阿魏酸作為研究對象，通過原代培養乳鼠海馬神經元構建缺氧缺糖模型，從細胞分子水平探討其配伍對缺氧缺糖致乳鼠海馬神經元細胞損傷的保護作用及其機制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷(批號SZ20170301HQJG, 純度≥98%)、阿魏酸(批號SZ20170305AWS, 純度≥98%)、川芎嗪(批號SZ20170402GXQ, 純度≥98%)、藁本內酯(批號SZ20170318GBNZ, 純度≥98%)對照品均購自南京植萃生物科技有限公司。尼莫地平片(批號170103)購自德國拜耳公司。DMEM/F12培養基(杭州基諾生物醫藥技術有限公司)；Neurobasal-A培養基、B27補充液(美國Gibco公司)；L-多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、D-Hanks液、0.25%胰酶(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法檢測試劑盒、微量丙二醛(MDA)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FITC AnnexinV Apotosis Detection Kit(美國BD公司)；caspase-3活性檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)。

1.2 動物 出生24 h內新生SD乳鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK(滬)2008-0016，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心。

1.3 儀器 倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺(上海博訊設備有限公司)；3111 CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；SX-500高壓滅菌鍋(日本Tommy公司)；LD25-2低速自動平衡離心機(北京醫用離心機廠)；Millipore Simplicity 純水儀(美國Millipore公司)；電熱鼓風干燥箱VBLC310(德國Heraeus公司)；Molecular Devices Spectra-MAX Plus 384酶標儀(美國MD公司)；BD FAC-Sculibar流式細胞儀(美國BD公司)；6孔細胞培養板、96孔細胞培養板(美國Corning公司)。

2 方法

2.1 細胞培養 將乳鼠按壓椎體處死，在75%乙醇中浸泡3 min，剪開顱骨，分離大腦半球，移入裝有冰浴D-Hanks液的培養皿中，剝離雙側海馬體，將其剪碎成大小約1 mm3的組織塊，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶，在37 ℃培養箱中消化20 min，每5 min振蕩搖勻使其完全消化，20 min后終止消化，200目篩網過篩，收集過篩后的細胞懸液至離心管中，1 000 r/min離心10 min，傾去上清液，用培養基重懸細胞，以1×105/mL的細胞密度接種于預先以多聚賴氨酸包被過的6孔板中，接種6 h后更換成飼養培養基(97% Neurobasal-A、2% B27、1%L-谷氨酰)，每3.5 d換液1次，第7天細胞成熟后，用于后續實驗。

2.2 細胞純度鑒定 多聚賴氨酸包被蓋玻片置于培養板中，接種海馬神經元，制作細胞爬片，7 d后待海馬神經元成熟后取出，滴加預冷PBS洗滌3次，預冷4%丙酮固定細胞30 min，PBS洗滌3次，滴加3%雙氧水室溫下封閉內源性過氧化物酶15 min，滴加PBS洗滌3次，使用0.3% Triton透化15 min，滴加PBS洗滌3次，加入10%山羊血清工作液，室溫封閉10 min，棄去山羊血清，滴加兔抗大鼠NSE多克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過夜，次日將濕盒放于37 ℃恒溫箱中復溫30 min，滴加PBS洗滌3次，加入生物素化山羊抗兔IgG二抗(1∶100)，放入恒溫箱再次孵育30 min，PBS洗滌5次，每次5 min，SABC顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞核被染成淡紫色，胞漿及突起被染成棕褐色者為海馬神經元細胞，其它細胞則不染色。隨機觀察4個視野中細胞情況，統計并計算其純度。

2.3 細胞毒性測定 將原代海馬神經元細胞密度調至1×105/mL后培養于96孔細胞培養板中， 待其生長成熟后加入用飼養培養基配置成的不同劑量單體有效成分，24 h后加入MTT溶液20 μL，4 h后吸棄培養基，加入150 μL DMSO，檢測各孔光密度(OD)，確定各單體有效成分細胞毒性劑量，以細胞存活率90%以上為安全給藥劑量，計算細胞存活率，確定其高、中、低劑量，并按照正交設計4因素3水平原則分成9組。

2.4 缺氧缺糖模型建立 取含有形態成熟的乳鼠海馬神經元的6孔培養板，將其分成12組，分別為正常組、模型組、陽性對照(尼莫地平)組(200 μg/mL)、配伍組(9組)，吸棄培養板中原培養基，使用無糖Earle’s培養液清洗3次，除正常組、模型組加不含藥物的無糖Earle’s培養液1 mL外，其余各組加入含有相應藥物的無糖Earl’s培養液1 mL，放入造模盒中(除正常組外)，充滿混合氣(95% N2、4% CO2、1% O2)，將造模盒移入37 ℃恒溫箱中放置3 h，取出各組培養板，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.5 海馬神經元凋亡情況檢測 多聚賴氨酸包被蓋玻片放于12孔培養板，將海馬神經元接種于其上制作細胞爬片，7 d后細胞爬片上海馬神經元成熟時，按“2.4”項下方法分組，吸棄原培養基，PBS清洗2次，除正常組、模型組加入不含藥物的無糖Earle’ s培養液1 mL外，其余各組加入含相應藥物的無糖Earle’s培養液1 mL，除正常組外均進行缺氧缺糖處理，處理完畢后棄去培養板中液體，PBS清洗，預冷的4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，滴加PBS清洗1次，加入Hoechst 33342熒光染料10 mg/L，恒溫培養箱中孵育30 min，在熒光倒置顯微鏡下觀察，以紫外光激發查看細胞染色結果。

2.6 SOD、LDH、GSH-Px活性與NO水平檢測 取細胞上清液，檢測各組LDH活性。按照試劑盒說明書，檢測細胞內SOD、GSH-Px活性及NO水平。

2.7 早期凋亡率檢測 取海馬神經元適量，按“2.4”項下方法分組，消化收集細胞，1×Binding buffer緩沖液重懸細胞，調整為3×105/mL的細胞懸液，取100 μL加到Falcon試管中，加AnnexinV- FTTC/ PI 500 μL，室溫置于暗處避光15 min，滴加1×Binding buffer緩沖液400 μL，流式細胞儀檢測海馬神經元早期凋亡，計算海馬神經元早期凋亡率。

2.8 海馬神經元caspase-3活性檢測 取海馬神經元適量，按“2.4”項下方法分組，按照說明書操作步驟檢測caspase-3活性。

3 結果

3.1 海馬神經元細胞形態及NSE純度 接種12 h后，細胞形狀不規則，有細小突觸，部分已貼壁生長,見圖1A。培養至第7天時，胞體飽滿清晰，立體感明顯，折光性變強，突起分支增多，互相交織形成明顯網狀結構，見圖1B。經檢測，細胞純度大于90%，可用于后續實驗，見圖2。

圖1 海馬神經元細胞形態(×100)

3.2 細胞安全劑量與配伍分組 采用MTT法，測得尼莫地平、黃芪甲苷、藁本內酯、阿魏酸、川芎嗪非細胞毒性劑量分別為200、10、10、40、400 μg/mL，再按照表1中的正交設計進行配伍分組。另外，選擇細胞存活率最高的200 μg/mL尼莫地平作為陽性對照組。

表1 正交設計配伍分組(μg/mL)

3.3 缺氧缺糖下海馬神經元細胞形態 如圖3所示，與正常組比較，模型組胞質腫大，折光性下降，胞體內出現空泡與凋亡小體，突起縮短斷裂，細胞脫壁現象明顯；與模型組比較，4個配伍組胞質腫脹變大現象減輕，折光性較為明顯，突起斷裂現象減輕，胞體中空泡及散在凋亡小體減少。

圖3 缺氧缺糖下各組海馬神經元形態

3.4 海馬神經元細胞Hoechst 33342染色形態 如圖4所示，正常組細胞形態完整，染色均勻，胞體發出均勻的淡藍色熒光；與正常組比較，模型組細胞熒光光度增強，胞體內可見大量亮藍色點狀或碎片狀熒光，細胞核染色較為致密，提示細胞損傷凋亡較嚴重；與模型組比較，配伍組細胞染色均勻，熒光亮度有不同程度的降低，少部分發出亮藍色熒光，胞體內亮藍色點狀或碎片狀熒光數量較少。

3.5 配伍對海馬神經元細胞SOD、LDH、GSH-Px活性及NO水平的影響 如表2所示，與正常組比較，模型組NO水平、LDH活性升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型組比較，配伍組、陽性對照組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低NO水平，抑制LDH活性(P<0.05，P<0.01)。

表2 配伍對海馬神經元細胞SOD、GSH-Px活性、NO水平及LDH漏出量的影響

3.6 配伍對海馬神經元細胞早期凋亡率及caspase-3活性的影響 如表3所示，與正常組比較，模型組細胞早期凋亡率、caspase-3活性升高(P<0.01)；與模型組比較，配伍組和陽性對照組細胞早期凋亡率、caspase-3活性降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 配伍對海馬神經元細胞早期凋亡率及caspase-3活性的影響

3.7 直觀分析 如表4～5所示，有效成分對SOD活性的影響程度依次為黃芪甲苷>藁本內酯>川芎嗪、阿魏酸，較優組合為A3B1C3D2；對GSH-Px活性的影響程度依次為黃芪甲苷>川芎嗪>藁本內酯>阿魏酸，較優組合為A2B2C3D1；對NO水平的影響程度依次為川芎嗪>黃芪甲苷>阿魏酸>藁本內酯，較優組合為A1B1C1D1；對LDH活性的影響程度依次為黃芪甲苷>阿魏酸>川芎嗪>藁本內酯，較優組合為A3B3C2D1；對caspase-3活性的影響程度依次為川芎嗪>阿魏酸>黃芪甲苷>藁本內酯，較優組合為A2B1C2D3；對細胞早期凋亡率的影響程度依次為川芎嗪>黃芪甲苷>阿魏酸>藁本內酯，較優組合為A2B1C2D3。

3.8 綜合平衡法

3.8.1 川芎嗪 川芎嗪對NO水平、caspase-3活性及海馬神經元細胞早期凋亡率都是影響最顯著的因素。對caspase-3活性、細胞早期凋亡率，取A2水平為宜；對其他指標而言，川芎嗪極差并非最大，選擇A2水平即可。綜合考慮，選擇A2水平。

3.8.2 黃芪甲苷 黃芪甲苷對SOD、LDH、GSH-Px活性都是影響最顯著的因素，而對NO水平、細胞早期凋亡率的影響程度僅次于川芎嗪。對GSH-Px、LDH、caspase-3活性及細胞早期凋亡率，取B2水平為宜；對于SOD活性、NO水平，取B1水平為宜，B2則次之。綜合考慮，選擇B2水平。

3.8.3 阿魏酸 阿魏酸對SOD、GSH-Px活性及NO水平的影響程度最小，對LDH、caspase-3活性及細胞凋亡率，取C2水平為宜；對GSH-Px活性、NO水平，取C1水平為宜；對SOD活性，取C3水平較好。綜合考慮，選擇C2水平。

3.8.4 藁本內酯 對SOD活性、NO水平、細胞早期凋亡率、caspase-3活性，取D2水平為宜；對GSH-Px、LDH活性，藁本內酯影響程度不明顯，取D2水平即可。綜合考慮，選擇D2水平。

3.8.5 最優配伍 最優配伍方案為A2B2C2D2，即川芎嗪200 μg/mL，黃芪甲苷5 μg/mL，阿魏酸20 μg/mL，藁本內酯5 μg/mL。

4 討論

缺血缺氧性腦病的病理損傷機理極其復雜，其中氧自由基連鎖反應損傷是其重要的核心機制之一[9-10]。通過對細胞中SOD、GSH-Px活性與NO水平進行檢測，能夠反映出機體缺氧狀態下的損傷程度，同時評估藥物治療效果，預估預后狀況[11]。當機體缺氧，腦細胞損傷時，LDH開始溢出細胞外，LDH溢出越多，細胞損傷越重。因此LDH活性能夠靈敏反映機體缺氧損傷程度的，是反映細胞損傷的重要指標。

細胞凋亡是導致腦缺血缺氧損傷的核心機制之一[12-13]，caspase-3活性檢測、形態學檢測及流式細胞術檢測細胞早期凋亡率是常用的重要手段[14]。腦缺血缺氧發生后，細胞線粒體膜受到損傷，通透性破壞，水分子內流使線粒體毒性腫脹，細胞色素C分泌釋放增多，caspase-3被大量激活，使細胞走向凋亡[15]。Hoechst 33342熒光染色將凋亡細胞中的細胞核濃染、胞漿濃縮及細胞出泡現象，是一種理想的檢測方法。流式細胞術檢測細胞凋亡能夠多個角度分析細胞凋亡。AnnexinV/PI雙染色法依據細胞凋亡時會出現磷脂酰絲氨酸外翻現象與AnnexinV對PS高親和性、PI對早期細胞拒染性等特性對凋亡細胞進行檢測。

本研究表明，與正常組比較，缺氧缺糖模型組能夠對海馬神經元細胞造成嚴重的損傷，能夠抑制SOD、GSH-Px活性，提高NO水平與LDH活性，激發細胞內部caspase-3活性，加重海馬神經元早期凋亡。與模型組比較，黃芪、川芎四種有效成分正交設計配伍組能夠不同程度地提高SOD、GSH-Px活性，減少NO水平與LDH活性，抑制caspase-3活性與細胞早期凋亡，其中黃芪甲苷能夠顯著增強機體抗氧化能力，而川芎嗪則抑制細胞早期凋亡率。通過極差分析法，較好配伍組合為A2B2C2D2。本研究對黃芪、川芎2味中藥重要有效成分的組分配伍對于缺氧缺糖狀態下的乳鼠海馬神經元損傷的保護作用及機制進行初步探討，并找出優勢配伍比例，為黃芪川芎的臨床配伍應用提供思路。