UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法分析桃紅四物湯物質基準中化學成分

李浩然， 王少平， 孫志強， 董萍萍， 柏道明， 高 鵬， 劉永俊， 代 龍*，張加余*

(1.濱州醫學院藥學院，山東 煙臺 264003；2.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250300；3.山東禹澤藥康產業技術研究院有限公司，山東 德州 251200；4.山東祥隆醫藥研究院有限公司，山東 煙臺 264003)

桃紅四物湯又名加味四物湯，是由桃仁、紅花、熟地、當歸、芍藥、川芎構成的的活血補氣之要方，最早記載于《醫宗金鑒》[1]，中醫臨床將該方用于血虛兼血瘀證及經期超前、血多有塊、色紫稠粘、腹痛等婦科疾病的治療[2-3]。桃紅四物湯物質基準是在提取方式遵循古法的前提下，將煎液冷凍干燥后所得，但目前關于其質量方面的報道較少，大多為臨床應用與成分定量研究[4-5]，更缺少全成分表征研究[6]。

超高效液相色譜串聯四極桿靜電場軌道阱質譜(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)技術具有高通量、高靈敏度、高分辨率等優點，可用于中藥復方化學成分的系統分析[7-9]。本實驗采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS法對桃紅四物湯物質基準中化學成分進行分析，以期為該方藥效物質基礎、質量控制、現代制劑開發提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器 UHPLC-Q Exactive-Orbitrap高分辨質譜，配置電噴霧離子源、XCalibur 2.1質譜工作站(美國Thermo Scientific公司)；AB204-N電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；BT25S電子天平(德國Sartorius公司)；MB-1-2封閉式調溫加熱器(北京科偉永興儀器有限公司)；BIL-500C超聲波清洗儀(上海比朗儀器制造有限公司)；LGJ-10C冷凍干燥機(北京四環福瑞科學儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 芍藥內酯苷(批號S-011-160304)對照品購自成都瑞芬思生物科技有限公司；羥基紅花黃色素A(批號111637-201810)、毛蕊花糖苷(批號111530-201713)、山柰酚(批號110861-202013)、阿魏酸(批號110773-201614)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。色譜純甲酸、乙腈、甲醇購自天津康科德科技有限公司；水純凈水(杭州娃哈哈飲用水有限公司)。

1.2 藥材 白芍、熟地、紅花、桃仁、當歸、川芎均由安徽億帆醫藥股份有限公司提供，經濟南市食品藥品檢驗所宋希貴研究員鑒定為正品，均符合2015年版《中國藥典》規定。

2 方法

2.1 物質基準制備 通過劑量考證，分別稱取酒地黃11.19 g、酒當歸14.92 g、白芍5.60 g、川芎3.73 g、桃仁3.78 g、紅花3.73 g，其中酒地黃制法為取生地黃適量，加入黃酒，蒸法蒸至黑潤，取出，曬至八成干，切厚片或塊，干燥；酒當歸制法為取當歸凈片適量，加黃酒拌勻，悶透，置炒制容器內，用文火炒干；其余藥味均依照2015年版《中國藥典》方法炮制。桃仁研泥，與地黃、當歸、白芍、川芎、紅花一同置砂鍋內浸泡30 min，第1次加9倍量水(385 mL)，用電陶爐作為熱源，先武火(600 W)加熱至沸，后文火(150～200 W)保持微沸30 min，第2次加7倍量水(300 mL)煎煮20 min，150目尼龍濾布過濾，煎液減壓濃縮至相對密度為1.11(40 ℃)，冷凍干燥，粉碎，混勻，分裝，即得。

2.2 溶液制備

2.2.1 全方供試品溶液 取物質基準0.034 g，置于10 mL量瓶中，加8 mL水超聲提取，加水至刻度，濾過，即得。

2.2.2 各單味藥供試品溶液 按照處方比例稱取各單味藥適量，按“2.1”項下方法制備凍干粉，分別取0.028 g，置于10 mL量瓶中，加8 mL水超聲提取，加水至刻度，濾過，即得。2.2.3 對照品溶液 精密稱取芍藥內酯苷、阿魏酸、山柰酚、羥基紅花黃色素A、毛蕊花糖苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為15.9、9.83、10.14、12.5 μg/mL的溶液，即得。

2.3 色譜條件 Waters ACQUITYTMC18色譜柱(150 mm× 2.1 mm，1.7 μm)；流動相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，95% A；1～35 min，95%～5% A；35～37 min，5%～95% A；37～40 min，95% A)；柱溫30 ℃；體積流量0.3 mL/min；進樣量1 μL。

2.4 質譜條件 正負離子掃描模式；鞘氣、輔助氣氮氣(純度≥99.99%)，體積流量30、10 L/min；毛細管溫度320 ℃；蒸發器溫度400 ℃；噴涂電壓為4 500～3 800 V；分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；掃描范圍m/z80～1 200；碰撞能30 eV。

3 結果

3.1 化學成分鑒定 采用Thermo Xcalibur 2.1工作站進行數據采集和處理，通過文獻比對、數據庫搜索、對照品比對、高分辨質譜數據分析共鑒定出了48種成分，包括10種有機酸、12種萜類、3種鞣質、4種黃酮、2種苯乙醇苷、17種其他類，總離子流圖見圖1，具體信息見表1。

表1 物質基準鑒定結果

圖1 物質基準在正(A)、負(B)離子模式下總離子流圖

3.2 有機酸 包括5-O-咖啡酰奎尼酸(4)、對羥基苯甲酸(5)、3-O-咖啡酰奎尼酸(8)、1-O-咖啡酰奎尼酸(10)、4-O-咖啡酰奎尼酸(14)、對香豆酸(17)等，在負離子模式下由于脫羧基易產生相差44(CO2)的碎片離子，因此其準分子離子峰不易被檢測，并且因咖啡酰基斷裂，易產生m/z179、191的特征碎片離子。以5-O-咖啡酰奎尼酸(4)為例，其負離子模式二級質譜圖見圖2A，準分子離子m/z353.087 04，保留時間3.96 min，分子式C16H18O9；其二級質譜中m/z179由分子離子于b位斷裂產生的咖啡酰基碎片離子，碎片離子m/z135比m/z179少44，是由后者中性丟失一分子CO2得到；離子m/z191為a位酰基斷裂產生的奎尼酸碎片離子，與文獻[14]報道一致，并通過比對組方與紅花二級質譜圖(圖2B)鑒定為5-O-咖啡酰奎尼酸，主要由紅花提供。另外，其余簡單有機酸類成分，如對羥基苯甲酸(5)、對香豆酸(17)、苯甲酸(20)的二級質譜中也可觀察到[M-H-CO2]-或[M+H-CO2]+的特征碎片離子。

圖2 M4于桃紅四物湯(A)、紅花(B)中的二級質譜圖

3.3 黃酮 裂解途徑見圖3。

11準分子離子m/z611.161 46，保留時間6.07 min，分子式C27H32O16，主要碎片離子為m/z119、287、259、m/z205，其中m/z287[M-H-2Glu]-是由分子離子于a、b位斷裂脫去2 Glu中性碎片所產生的碎片離子；m/z259比m/z287少28，推測為CO的中性丟失，連續丟失3分子水后生成m/z205；m/z205于c位斷裂后，生成m/z119。與對照品比對，鑒定為羥基紅花黃色素A。

41準分子離子m/z285.039 55，保留時間13.98 min，分子式C15H10O6，分子離子在a位發生RDA裂解后產生m/z133碎片離子，m/z117比m/z133少16，故推斷后者脫氧產生m/z117，并于b位斷裂產生了m/z93。與對照品比對，鑒定為山柰酚。

25準分子離子m/z623.160 34，保留時間9.64 min，分子式C28H32O16，通過中性丟失鼠李糖基(308Da)產生m/z315；離子m/z300比m/z315少15，推測后者丟失CH3產生m/z300；m/z300發生RDA裂解，產生m/z153，后者脫去一分子O后又產生了m/z135。與對照品比對，鑒定為異鼠李素蕓香糖苷。

3.4 萜類 裂解途徑見圖3。

圖3 M11、M41、M18、M28、M2、M21二級質譜圖及裂解規律

18準分子離子m/z479.154 48，保留時間7.95 min，分子式C23H28O11;分子離子于a位脫去一分子氧后產生m/z463，進而在b位脫去蒎烷基本骨架產生m/z165、135的互補離子對；離子m/z121比m/z135少14，故推測后者脫去CH2后產生前者。與對照品比對，鑒定為芍藥苷。

28準分子離子m/z497.16537，分子式C23H30O12；分別于a、b位發生斷裂產生的二級碎片離子m/z167[M-H-C15H22O8]-、123[M-H-C15H22O8-CO2]-與上述裂解規律相同。與對照品比對，鑒定為6-O-香草酰基筋骨草醇。

22、29在負離子模式下均檢測到了由糖基6號位脫去的沒食子酰基產生的碎片離子m/z169，以及苯甲酰基碎片所產生的離子m/z121，判斷兩者為沒食子酰芍藥苷或其異構體。

33在負離子模式下產生的碎片離子m/z463、121、165均與芍藥苷裂解規律相同。與對照品比對，鑒定為芍藥內酯苷。

30、35、36～39、42二級碎片離子均與上述裂解規律相同，或與相關文獻報道一致。與對照品比對，分別鑒定為地黃苦苷、芍藥新苷、地黃苷或其異構體、牡丹皮苷B。

3.5 鞣質類 裂解途徑見圖3。

2準分子離子m/z463.118 99，保留時間1.67 min，分子式C19H26O15；分子離子在a位斷裂脫去蔗糖后產生m/z169，由于m/z125比m/z169少44，推測后者脫去一分子CO2后產生前者。與文獻[21]比對，鑒定為沒食子酰蔗糖。

32、34二級質譜內均發現了阿魏酰基的碎片離子，兩者裂解行為與沒食子酰蔗糖類似。與文獻[14]比對，鑒定為6-O-E-阿魏酰基筋骨草醇或其異構體。

3.6 苯乙醇苷類 裂解途徑見圖3。

21準分子離子m/z623.196 90，保留時間9.27 min，分子式C29H36O15；二級碎片離子有m/z179、161、315、135；分子離子由a位斷裂產生咖啡酸離子m/z179，進而脫去一分子H2O生成碎片離子m/z161；離子m/z315[M-H-caffeoyl-C6H10O4]-是由分子離子依次脫去咖啡酰基、鼠李糖殘基產生，再繼續丟失一分子葡萄糖并脫水后得到m/z135[M-H-caffeoyl- C6H10O4-Glu-H2O]-。與對照品比對，鑒定為毛蕊花糖苷。

27質譜中展現了與毛蕊花糖苷相同的裂解方式。與對照品比對，鑒定為異毛蕊花糖苷。

3.7 其他 通過數據庫分析結合文獻比對，鑒定9、24、26、31、44～46分別為hamnopyranosyl vanilloyl、焦地黃苷B1、焦地黃苷B2、eriodictyol hexoside、十八烯酸或其異構體。

4 討論

桃紅四物湯作為傳統調經要方之一，具有活血化淤、調經止痛等功效。咖啡酰奎尼酸類化合物對于改善局部血液微循環有著顯著效果[28]，臨床用于急性腦卒中患者的治療。金鳴等[29]發現羥基紅花黃色素A通過拮抗PAF受體，緩解PAF誘發人臍靜脈血管內皮細胞炎癥介質白細胞介素(IL)-1B、IL-6、ICAM-1和VCAM-1mRNA的升高，達到鎮痛的效果。吳麗等[30]研究表明芍藥苷對原發性痛經模型小鼠具有解痙鎮痛作用，能使小鼠潛伏期延長、扭體次數減少，子宮組織PGF2水平降低、NO水平升高。本研究鑒定成分與桃紅四物湯傳統藥效的重疊性，證實了藥效化學成分在桃紅四物湯內的傳遞性與可測定性。

綜上所述，桃紅四物湯物質基準具成分特有性且關聯藥效，與劉昌孝院士提出的中藥質量標志物(Q-marker)理論[31]不謀而合。本研究利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術對桃紅四物湯物質基準進行分析鑒定，初步鑒定并推測出了毛蕊花糖苷，芍藥苷，地黃苦苷，羥基紅花黃色素A，5-O-咖啡酰奎尼酸，對香豆酸等48種成分。為探明桃紅四物湯質量標志物提供了原始數據庫，為提升桃紅四物湯質量標準水平打下了基礎。