柴胡注射液細菌內毒素檢查法的研究

任仲麗， 張秀花， 王 靜， 劉 博， 李秀菊

(菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院生物檢測研究所，山東 菏澤 274023)

柴胡注射液是柴胡干燥根經水蒸氣蒸餾制成的滅菌水溶液，主要成分為揮發油(柴胡醇、丁香酚等)，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的作用[1-3]。高陽等[4]研究發現，柴胡注射液對脂多糖導致的高熱有較強的解熱作用，解熱療效確切，臨床應用廣泛。但由于不良反應較多，國家食品藥品監督管理局批準生產柴胡注射液的企業從2012年的120家左右減到現在的70家[5-7]。同時，由于兒童群體的不良反應占比較大[8-13]，2018年5月29日國家食品藥品監督管理局發布公告，修訂柴胡注射液說明書，增加“兒童禁用”條款[14]。本研究依照2020年版《中國藥典》四部1143細菌內毒素檢查法的凝膠法，建立和探討柴胡注射液的細菌內毒素檢查方法的可行性，以期為制藥企業提高藥品質量、減少由于熱原引起的不良反應、確保用藥安全提供依據。

1 材料

1.1 藥物 柴胡注射液1(河南福森藥業有限公司，批號1805061，2 mL/支)；柴胡注射液2(河南省康華藥業股份有限公司，批號18082603A，2 mL/支)；柴胡注射液3(海南制藥廠有限公司制藥二廠，批號180101052，2 mL/支)；柴胡注射液4(河南福森藥業有限公司，批號1802011，2 mL/支)；柴胡注射液5(河南省康華藥業股份有限公司，批號19051202，2 mL/支)；柴胡注射液6(海南制藥廠有限公司制藥二廠，批號180101263，2 mL/支)。

1.2 試劑 細菌內毒素工作標準品(WSE，中國食品藥品檢定研究院，批號150601-202088，60 EU/支)。鱟試劑1(TAL1，湛江安度斯生物有限公司，靈敏度0.25 EU/mL，0.1 mL/支，批號1907081)；鱟試劑2(TAL2，湛江博康海洋生物有限公司，靈敏度0.25 EU/mL，0.1 mL/支，批號1904032)。細菌內毒素檢查用水(BET，廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，10 mL/支，批號20036004)。

1.3 儀器 TAL-40D型試管恒溫儀(湛江安度斯生物有限公司)；ZH-2型自動漩渦混合器(天津藥典標準儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 內毒素限值的確定 按照2020年版《中國藥典》四部1143細菌內毒素檢查法規定，藥品細菌內毒素限值(L)=K/M，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/(kg·h)表示，M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。注射劑K為5 EU/(kg·h)，根據柴胡注射液說明書，一次最大注射量為4 mL，計算得到M為0.067 mL/(kg·h)，即細菌內毒素限值為75 EU/mL[15]。

參照2020年版《中國藥典》四部9301細菌內毒素檢查項下對限值設定的建議，同時考慮到柴胡注射液臨床上常聯合用藥且不良反應較多，嚴格控制細菌內毒素限值為其計算限值的1/5，即以15 EU/mL為最終內毒素限值[15]。

2.2 確定最大有效稀釋倍數(MVD) 根據2020年版《中國藥典》四部9301規定，結合常用鱟試劑的靈敏度，公式為MVD=cL/λ，c為供試品溶液濃度，λ為鱟試劑靈敏度，依次得MVD為60、120、240、480倍[15]。

2.3 TAL靈敏度復核 本實驗選用標示靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，按照2020年版《中國藥典》四部通則1143規定，首先進行鱟試劑的標示靈敏度復核[15]，按公式λc=anti1g(∑X/n)計算鱟試劑靈敏度的測定值(λc)。λc均在0.5λ～2λ范圍內，表明TAL1、TAL2可用標示靈敏度0.25 EU/mL為該批次鱟試劑的靈敏度，并可用于干擾試驗及供試品的細菌內毒素檢查，見表1。

表1 TAL靈敏度復核試驗結果(n=4)

2.4 干擾預試驗 按“2.2”項下方法計算MVD，將2家企業生產的2批柴胡注射液用BET水稀釋30、60、120、240、480倍，作為供試品溶液(NPC)，其中2λ濃度的溶液作為供試品陽性對照溶液(PPC)，按照2020年版《中國藥典》四部通則1143規定測定，結果見表2。由此可初步判定，柴胡注射液稀釋30倍時，對2個廠家TAL與WSE無明顯干擾抑制作用。

表2 柴胡注射液干擾預試驗結果(n=2)

為進一步確定柴胡注射液對TAL與WSE的干擾作用，取上述2家企業生產的2批柴胡注射液原液及用BET水稀釋2、4、8、15倍的供試品溶液重復進行上述試驗，結果見表3。由此可初步判定，柴胡注射液原液對2個廠家的TAL與WSE無明顯干擾抑制作用，可進行正式干擾試驗。

表3 柴胡注射液干擾預試驗結果(n=2)

2.5 正式干擾試驗 為了最終確認柴胡注射液對細菌內毒素檢查法是否存在干擾抑制作用，根據“2.4”項下結果，取3家企業生產的3批柴胡注射液，使用2個廠家生產的標示靈敏度為0.25 EU/mL的TAL，按照2020年版《中國藥典》四部1143中凝膠法干擾試驗要求操作，結果見表4。由此可知，按照2020年版《中國藥典》的判斷標準，柴胡注射液原液對2個廠家的TAL與WSE無明顯干擾抑制作用，確定柴胡注射液可使用現市售標示靈敏度為0.25～0.03 EU/mL TAL進行細菌內毒素檢查。

表4 柴胡注射液干擾試驗結果

2.6 驗證試驗 另取3家企業生產的3批柴胡注射液，按本研究建立的細菌內毒素檢查法進行常規檢查，驗證方法的可行性，結果見表5。由此可知，按本研究方法檢查時均符合規定。

表5 柴胡注射液細菌內毒素檢查結果(n=2)

2.7 凝膠半定量試驗 為驗證凝膠限度試驗與凝膠半定量試驗檢驗結果的一致性，取3家企業生產的3批柴胡注射液，制成原液及2、4、8倍稀釋溶液，作為供試品溶液；用BET水將細菌內毒素工作標準品制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度的溶液，作為陽性對照；用柴胡注射液原液將細菌內毒素工作標準品制成2λ濃度的內毒素溶液，作為供試品陽性對照溶液，同時用BET水作為陰性對照，使用2個廠家生產的標示靈敏度為0.25EU/mL的TAL，按照2020年版《中國藥典》四部1143中凝膠半定量試驗要求操作，結果見表6。由此可知，3家企業生產的3批柴胡注射液的系列稀釋供試品溶液均為陰性，則細菌內毒素含量低于0.25 EU/mL。

表6 柴胡注射液凝膠半定量試驗結果(n=2)

2.8 細菌內毒素檢查標準草案 取本品依法(2020年版《中國藥典》四部通則1143)檢查，規定柴胡注射液中含內毒素含量應低于15 EU/mL。

3 討論

柴胡注射液是我國自主研發成功的第一個中藥注射劑，對中醫藥發展具有重要的意義[16-17]，廣泛應用于臨床，但由于生產工藝、原輔料等條件的制約，其不良反應也被頻繁報道。因此，監管部門明文規定柴胡注射液“兒童禁用”[8-14]。

眾所周知，注射劑常見的不良反應之一就是引起熱源反應，柴胡注射液在臨床上通常與西藥聯合用藥，更容易導致內毒素超標，而且柴胡注射液為純中藥制劑，成分復雜，從臨床用藥安全等多方面考慮，有必要增加細菌內毒素檢查[18-23]。目前，我國現行柴胡注射液檢驗標準中沒有細菌內毒素檢查項目，而是采用動物實驗法的熱原檢查項目，但其操作繁瑣，結果受家兔個體差異的影響較大，并會對動物造成一定的傷害。

本研究為避免上述問題，探索替代熱原檢查法的細菌內毒素檢查法，通過干擾預試驗、正式干擾試驗確定柴胡注射液對細菌內毒素檢查法是否存在干擾作用，確定其最小不干擾稀釋倍數，并進行驗證試驗。結果表明，當設定細菌內毒素限值為15 EU/mL時，使用標示靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑，采用凝膠法進行柴胡注射液的細菌內毒素檢查是可行的，并通過凝膠半定量法驗證了凝膠限度試驗檢驗結果的一致性，為建立柴胡注射液的細菌內毒素檢驗標準提供了試驗依據。

綜上所述，建議將柴胡注射液質量標準中的熱原檢查項改為細菌內毒素檢查項，規定其含量應低于15 EU/mL。