萬古霉素高產菌株選育及發酵配方優化

王會會 程啟東 戴夢 趙建強 任風芝 葛鹍鵬 張志江

摘 要：為了提高東方擬無枝酸菌產萬古霉素的發酵單位，降低生產成本，采用紫外誘變、常壓室溫等離子體誘變對東方擬無枝酸菌出發菌株V19-02進行誘變處理，通過篩選鏈霉素抗性突變菌株，選育高產菌株;通過對發酵培養基中碳源和氮源進行篩選，選取葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉4個因素進行均勻設計。結果表明，獲得的高產菌株V19-1-07搖瓶發酵單位提高33.7%，且具有良好的傳代穩定性;優化后的培養基配比質量分數為葡萄糖8.0%、淀粉1.0%、低溫豆粉1.0%、酵母粉4.0%、氯化鈉1.0%、磷酸二氫鉀0.1%;小試結果證明，優化配方可使50 L罐發酵單位平均達到14 110 μg/mL，比原始配方提高了28.9%。因此，研究獲得的高產菌株V19-1-07可應用于萬古霉素工業化發酵生產，以幫助企業降低成本，進一步提高競爭力。

關鍵詞：發酵工程;萬古霉素;復合誘變;菌種選育;均勻設計;東方擬無枝酸菌

中圖分類號：TQ465.9?? 文獻標識碼：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2022yx03011

Breeding of high vancomycin producing strains and optimization of fermentation formula

WANG Huihui1，2，3，CHENG Qidong4，DAI Meng1，2，3，ZHAO Jianqiang4，REN Fengzhi1，2，3，

GE Kunpeng1，2，3，ZHANG Zhijiang4

（1.New Drug Research & Development Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;2.National Engineering Research Center of Microbial Medicine，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;3.Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;4.Huasheng Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China）

Abstract：In order to increase the yield of vancomycin by Amycolatopsis orientalis and reduce the cost，the original strain Amycolatopsis orientalis V19-02 was treated by UV and atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）.High yield strains were selected by screening streptomycin resistance treatment.Meanwhile，the carbon sources and nitrogen sources of fermentation medium were optimized and four factors including glucose，starch，low-temperature soybean powder and yeast powder were selected for uniform design experiment.The results show that the yield of vancomycin fermentation of the high-yield mutant strain Amycolatopsis orientalis V19-1-07 is increased by 33.7% in flask culture.In addition，the strain has an excellent propagating stability.The optimal fermentation medium is as follows：glucose 8.0%，starch 1.0%，low-temperature soybean powder 1.0%，yeast powder 4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1%.The experimental results show that the production of vancomycin reachs 14 110 μg/mL under the optimal conditions by the strain V19-1-07 in 50 L fermentor，which is 28.9% higher than the original formula.After applied to large-scale production，it is conductive to reduce the cost and improve the competitiveness of enterprises further.

Keywords：

fermentation engineering;vancomycin;complex mutagensis;strain breeding;uniform design;Amycolatopsis orientalis

萬古霉素（vancomycin）由東方擬無枝酸菌發酵所得，其通過抑制細菌的生長和繁殖來殺死細菌[1]，是臨床上用于治療由耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）引起的嚴重感染疾病的重要藥物[2]。萬古霉素的應用日漸增多，在巨大的市場前景下，提高發酵單位、降低生產成本，有利于企業在競爭中占據有利地位[3-4]。

中國生產萬古霉素的廠家（如浙江新昌制藥、浙江海正藥業、重慶大新藥業及華北制藥等）都在致力于提高發酵單位的研究。江蘇海闊生物醫藥有限公司[5]采用核糖體誘變選育方法獲得的萬古霉素生產菌株發酵液產量（質量濃度，下同）高達8.9 g/L，且菌株傳代穩定，連續傳代5次后萬古霉素產量穩定性高達92.7%;北大方正集團有限公司等[6]通過在發酵過程中每天補加0.1%～0.5%（質量分數）的硫酸銨，萬古霉素含量（質量濃度，下同）提高到9 500 μg/mL以上，最高可達到10 157 μg/mL。常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）具有操作簡單、突變率高、獲得的突變株穩定性好，已在諸多領域應用并取得成效[7]。關亞鵬等[8]應用ARTP誘變選育非達霉素高產菌株，搖瓶發酵能力比出發菌株提高了42.9%。

本研究采用一系列誘變篩選措施對萬古霉素產生的菌株東方擬無枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02進行選育，旨在獲得萬古霉素高產菌株，并且通過優化發酵培養基，進一步提高萬古霉素的發酵單位。

1 材 料

1.1 菌種

研究所用菌種為東方擬無枝酸菌（Amycolatopsis orientalis） V19-02，由華北制藥華勝有限公司提供。

1.2 培養基

1）種子培養基（除pH值外，其余物質含量均為質量濃度）

葡萄糖為20.0 g/L，蛋白胨為5.0 g/L，NaCl為5.0 g/L，K2HPO4為0.3 g/L，pH值為7.0～7.2。

2）發酵培養基（除pH值外，其余物質含量均為質量濃度）

葡萄糖為30.0 g/L，工業淀粉為80.0 g/L，酵母粉為10.0 g/L，低溫豆粉為15.0 g/L，NaCl為1.0 g/L，KH2PO4為0.1 g/L，pH值為7.0～7.2。

1.3 主要原材料和儀器設備

1）原材料

葡萄糖，河北金鋒淀粉糖醇有限公司提供;蛋白胨，石家莊賽特工貿有限公司提供;工業淀粉，河北興柏藥業集團有限公司提供;酵母粉，浙江東成生物科技股份有限公司提供;低溫豆粉，欒城縣通大工貿有限公司提供;無機鹽，均由天津市永大化學試劑有限公司提供。

2）儀器設備

發酵搖瓶機（New Brunswick Scientific Innova 2300），Eppendorf公司提供;ARTP-IIS等離子誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司提供;LC-2030C高效液相色譜儀，島津公司提供;PICO 21離心機，Thermo公司提供。

2 方 法

2.1 檢測方法

1）菌體濃度的檢測

采用PMV法（packed mass volume）測定菌體生物量[9]。

2）樣品處理方法

取發酵液1.0 mL，用體積分數2.0%的硫酸溶液定容至10 mL，浸泡60～90 min，3 000 r/min離心10 min后取上清液進樣。

3）HPLC檢測色譜條件

色譜柱（Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-四氫呋喃-三乙胺水（pH值為3.2，體積分數為0.2%），三者體積比為7∶1∶92），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長為280 nm。

2.2 培養方法

1）斜面及平板培養

取冷凍保存的甘油管接入斜面培養基或誘變處理的單孢子懸液涂布于平板培養基，28 ℃培養6～8 d。

2）種子培養

挖取約0.5 cm2斜面孢子接入裝有30 mL種子培養基的三角瓶中，搖床轉速為220 r/min，28 ℃培養24 h。

3）發酵培養

種子培養液以體積分數5%的接種量接于裝有30 mL發酵培養基的三角瓶中，搖床轉速為220 r/min，28 ℃培養6 d放瓶。

4）50 L罐培養

采用兩級發酵，母瓶種子液以體積分數0.5%接種于10 L種子培養基中，28 ℃培養48 h后以體積分數5%接種量轉接于30 L發酵培養基中，發酵過程中通氣比為1 m3/（m3·min-1），初始攪拌轉速為350 r/min，發酵過程中通過控制攪拌調節溶氧量，保證最低溶氧量不低于20%（體積分數）。發酵50 h后用氨水控制pH值不低于7.2，28 ℃培養7 d放罐。

2.3 高產菌株選育

2.3.1 單孢子懸液的制備

取生長良好的斜面2支，加入無菌水洗下孢子，轉入裝有玻璃珠的三角瓶中，搖床120 r/min振蕩15 min打散菌體，過濾后制備成約106個/mL的單孢子懸液。

2.3.2 鏈霉素最低抑制濃度的確定

取50 μL單孢子懸液分別涂布于含有不同濃度鏈霉素的平板培養基中，28 ℃培養6～8 d。

2.3.3 復合誘變選育菌株

1）紫外誘變

取單孢子懸液置無菌平皿中，于紫外誘變箱（照射距離為30 cm，紫外功率為30 W）分別照射30，40，60，80，100 s，稀釋涂布于平板培養基中，28 ℃培養6～8 d。根據菌落大小和形態特征，每個誘變條件下挑選80～100個單菌落按照2.2項的方法進行篩選，計算突變率。

2）ARTP誘變

取單孢子懸液涂于金屬載片上，于ARTP誘變箱（電源功率為110 W，工作氣流量為10 L/min，照射距離為2 mm），分別處理15，30，45，60，90 s后，稀釋涂布于平板培養基中，28 ℃培養6～8 d。根據菌落大小和形態特征，每個誘變條件下挑選80～100個單菌落按照2.2項的方法進行篩選，計算突變率。

3）復合誘變

根據確定的最佳條件紫外照射60 s、ARTP誘變45 s，采用復合誘變處理萬古霉素單孢子懸液。

2.3.4 鏈霉素抗性菌株選育

將復合誘變處理的單孢子懸液涂布于含鏈霉素1 500 μg/mL（質量濃度）的抗性平板上，長出的菌株即為抗性菌株，通過搖瓶試驗篩選高產菌株。

2.4 發酵培養基優化

2.4.1 碳源的選擇

選取葡萄糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油作為基礎碳源，進行單因素試驗，考察碳源對萬古霉素的影響。

2.4.2 氮源的選擇

選取低溫豆粉、高溫豆粉、硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕作為基礎氮源，進行單因素試驗，考察氮源對萬古霉素的影響。

2.4.3 均勻設計優化培養基成分

選取單因素試驗中影響效果較大的葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉4個因素為自變量，分別用X1，X2，X3和X4表示，發酵效價為因變量，用Y表示;根據均勻設計V4.0版軟件提供的模型設計實驗，篩選高產菌株發酵的最適配方。

3 結果與分析

3.1 鏈霉素最低抑制濃度的確定

將東方擬無枝酸菌菌懸液涂布于鏈霉素抗性平板，隨著抗性濃度的增加菌落生長越來越弱，當抗性濃度（質量濃度，下同）達1 500 μg/mL時，平板上無菌落生長，表明鏈霉素對東方擬無枝酸菌出發菌株的最低抑制濃度（質量濃度，下同）為1 500 μg/mL。

3.2 誘變條件的選擇

對出發菌株誘變處理結果見表1和表2。由表可見，隨著紫外（UV）和ARTP誘變處理時間延長，致死率越高，負突變率也越高，而正突變率呈上升又下降的趨勢。紫外處理60 s時，致死率為95.4%，正突變率高達20.5%。ARTP處理45 s和60 s時，正突變率分別為18.7%和17.8%，相差不大，但負突變率差距明顯，故選擇45 s作為最佳處理時間。

3.3 復合誘變及鏈霉素抗性篩選

按照2.3.3項和2.3.4項的方法處理篩選萬古霉素高產菌株，挑選出245個生長良好的單菌落，經多次搖瓶篩選，獲得8株發酵水平提高20%以上的菌株，其中菌株V19-1-07提高幅度達到33.7%，結果見圖1和表3。

經誘變處理后，東方擬無枝酸菌在平皿固體培養基上菌落形態突起、高聳，有褶皺或呈火山狀突起，產孢子情況明顯差異（見圖2），從中挑取單菌落，用搖瓶試驗篩選高產菌株。

3.4 高產菌株穩定性

菌株傳代穩定性是決定其能否用于工業化生產的重要因素[10]。將選育的高產菌株V19-1-07采用斜面傳代方式，考察穩定性，連續傳代5次，進行搖瓶實驗測定發酵效價，結果見表4。菌株V19-1-07從F1到F4代，發酵效價波動水平不超過10%，說明高產菌株具有良好的傳代穩定性，有利于規模化工業生產。

3.5 發酵培養基優化

3.5.1 碳源的優化

微生物的生長繁殖和合成產物均離不開碳源物質。發酵工業中常用的碳源有糖類、油脂、有機酸和小分子醇等。本研究選取葡萄糖、麥芽糖、糊精、淀粉、甘油為唯一碳源，考察不同碳源對高產菌株V19-1-07生長和合成萬古霉素的影響，結果見圖3。

由圖3可知，淀粉和葡萄糖對東方擬無枝酸菌菌絲生長和合成產物均有利，發酵單位明顯高于其他碳源，因此，選取淀粉和葡萄糖進行后續試驗。

3.5.2 氮源的優化

發酵培養基中氮源主要用于菌體細胞物質（氨基酸、蛋白質、核酸等）和含氮代謝物的合成。本研究選取低溫豆粉、高溫豆粉、硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕分別作為唯一氮源，考察不同氮源對萬古霉素高產菌株V19-1-07的影響，結果見圖4。低溫豆粉和酵母粉作為唯一氮源時，發酵液中萬古霉素含量明顯高于其他氮源，因此，選取酵母粉和低溫豆粉作為氮源進行后續試驗。

3.5.3 均勻設計優化培養基

按照2.4.3項的方法，設置4個因素、6個水平進行均勻設計優化，其中，4個因素分別為葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉，賦值（質量分數，下同）范圍分別為1.0%～8.0%，2.4%～8.0%，1.0%～4.0%，1.0%～4.0%，設計的U6（64）試驗方案以及優化結果見表5。

利用均勻設計V4.0版軟件進行分析，采用最優回歸子集法得到發酵效價（Y）對4個因素（葡萄糖（X1）、淀粉（X2）、低溫豆粉（X3）、酵母粉（X4））的回歸方程：Y=277.106 526 3+899.378 027 7X1-77.148 630 8X1X1+112.085 849 6X1X4-18.138 399 4X2X3。

對回歸方程的各項參數進行方差分析，結果見表6，得到的最優解見表7。

由回歸方程的方差分析表6可見，相關系數R2值和p值都很合理，說明方程擬合很好，方程有極其顯著的意義。確定的發酵培養基優化配方為葡萄糖8.0%，淀粉1.0%，低溫豆粉1.0%，酵母粉4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1% 。

3.6 50 L發酵罐驗證

采用優化后的培養基配方，使用2.2項的方法，在50 L發酵罐中進行配方驗證，結果見表8。由表可見，被均勻設計試驗優化后的培養基配方，使發酵效價較原來提高28.9%，高產菌株在50 L罐代謝曲線和發酵液檢測結果如圖5和圖6所示。由圖5可見，高產菌株V19-1-07在50 L發酵罐中，前40 h菌體生物量快速增長，總糖急劇下降，隨著發酵時間延長，菌體緩慢增長，進入次級代謝階段，產物快速合成，呈直線上升趨勢。發酵160 h后溶氧量和pH值都開始回升，總糖質量濃度降至10 g/L左右，表明發酵結束。

4 討 論

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變是利用在常溫（25～40 ℃）和常壓下（1個標準大氣壓），產生高活性粒子（包括處于激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）的等離子體射流作用于生物體，影響細胞內的蛋白質活性，進而使微生物基因序列及其代謝網絡發生變化，產生明顯的誘變效果[11]。ARTP具有操作簡單、突變穩定性好等特點。李磊[12]應用ARTP獲得了小球藻突變株BYQ-1，生物量比出發株增加了13.24%。肖志強等[13]采用ARTP誘變處理黏著劍菌，篩選出高產維生素B12的誘變菌株，經過2輪ARTP誘變處理后搖瓶發酵單位相比于原始菌株提高了24.8%。張拴力等[14]采用ARTP誘變乳酸乳球菌，獲得一株產乳酸鏈球菌素達到6 120 IU/mL的突變株。紫外和化學誘變等傳統誘變育種方法是獲得高產菌株的一種經濟有效的方法，多年來一直應用于工業微生物菌種的改良。但是，長期、重復使用某種誘變源，往往導致突變率低、突變譜窄和抗性飽和[15]。兩種或多種誘變劑同時使用的復合誘變處理可擴大突變的位點范圍，增大獲得正突變株的可能性。胡悅等[16]采用LiCl-ARTP復合誘變處理地衣芽孢桿菌，獲得了高產堿性蛋白酶的優良菌株。黃玉等[17]用紫外和ARTP復合誘變金龜子綠僵菌，獲得了產孢量高、耐紫外線、毒力強、遺傳穩定的高性能優良菌株。

研究發現，鏈霉素抗性與核糖體蛋白上氨基酸殘基的改變有關，這些特定位點的突變會啟動菌體產生抗生素，從而提高次級代謝產物的產量[18-19]。目前核糖體工程中主要采用鏈霉素、利福霉素、慶大霉素等抗生素作為篩選壓力，該方法能夠快速提高抗生素的產量，耗費時間較少。魯鳳娟等[20]利用核糖體工程技術選育得到了米爾貝霉素的高產菌株，李文華等[21]應用該技術選育了卡伍爾鏈霉菌高產菌株。

本研究首次將ARTP誘變選育技術應用于東方擬無枝酸菌（Amycolatopsis orientalis），并結合紫外誘變和鏈霉素抗性篩選，對出發菌株萬古霉素產生菌V19-02進行誘變育種，獲得的高產菌株V19-1-07搖瓶發酵水平較出發菌株提高了33.7%，且具有良好的遺傳穩定性，可用于萬古霉素工業化發酵生產。

5 結 語

本研究通過復合誘變和抗性篩選選育萬古霉素高產菌株，采用均勻設計優化發酵培養基配方，經50 L罐驗證后，較初始提高28.9%。經選擇誘變條件，結果發現，紫外誘變處理60 s 時正突變率為20.5%，ARTP誘變處理45 s時正突變率達18.7%，鏈霉素對東方擬無枝酸菌的最小抑制濃度為1 500 μg/mL，經以上誘變技術選育的高產菌株V19-1-07從F1到F4代，發酵效價波動水平不超過10%，遺傳穩定，表明東方擬無枝酸對誘變處理較敏感，ARTP誘變和核糖體工程技術用于東方擬無枝酸菌誘變選育可行有效。通過均勻設計試驗對篩選出的葡萄糖、淀粉、低溫豆粉、酵母粉4個因素進行優化，優化后的發酵培養基配方中淀粉比例由初始的80 g/L降為10 g/L，降低了培養基的黏稠程度，有利于徹底滅菌，避免了染菌情況的出現。同時培養基變的稀薄，增加了溶氧的傳遞，有利于菌絲生長。

在鏈霉素抗性篩選過程中，以含鏈霉素最小抑制濃度1 500 μg/mL的抗性平板進行突變菌株篩選，進行搖瓶實驗篩選得到鏈霉素抗性不小于1 500 μg/mL的突變菌株，復篩后獲得8株發酵水平提高20%以上的菌株。下一步可繼續考察這8株菌的鏈霉素抗性濃度，探索鏈霉素抗性與萬古霉素產量之間的關系。均勻設計優化后的發酵培養基配方中葡萄糖質量濃度為80 g/L，由于葡萄糖含量較高，在以后的發酵工藝優化中可降低初始葡萄糖含量，采用補糖的方式提供碳源，考察分批補料發酵對萬古霉素發酵的影響，該方式提高碳源的轉化率，降低發酵成本，有利于企業競爭力的提升。

參考文獻/References：

[1] MCINTYRE J J，BULL A T，BUNCH A W.Vancomycin production in batch and continuous culture[J].Biotechnology and Bioengineering，1996，49（4）：412-420.

[2] NAGARAJAN R.Antibacterial activities and modes of action of vancomycin and related glycopeptides[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1991，35（4）：605-609.

[3] 段心雨，韋紅.萬古霉素在新生兒感染性疾病應用中的研究進展[J].中國當代醫藥，2020，27（15）：44-47.

DUAN Xinyu，WEI Hong.Research advances in the application of Vancomycin in neonatal infectious diseases[J].China Modern Medicine，2020，27（15）：44-47.

[4] 戈家傲，劉暢，龔建剛，等.抗菌環肽的研究進展[J].中國生物工程雜志，2018，38（11）：76-83.

GE Jiaao，LIU Chang，GONG Jiangang，et al.Research progress of antibacterial cyclopeptides[J].China Biotechnology，2018，38（11）：76-83.

[5] 江蘇海闊生物醫藥有限公司.一種萬古霉素菌株及其發酵產萬古霉素的方法：CN106520589A[P].2017-03-22.

[6] 北大方正集團有限公司，北大醫藥重慶大新藥業股份有限公司，北大醫療產業集團有限公司.一種萬古霉素的發酵方法：CN109504729A[P].2019-03-22.

[7] 邢新會，張翀，李和平，等.常壓室溫等離子體快速基因組突變技術和裝置研究[C]//中國化工學會生物化工專業委員會.全國生物化工技術發展研討會論文集.常州：中國化工信息中心，2010：42-43.

[8] 關亞鵬，張莉，米貫東，等.應用常壓室溫等離子體誘變技術選育非達霉素高產菌株[J].中國抗生素雜志，2017，42（8）：643-646.

GUAN Yapeng，ZHANG Li，MI Guandong，et al.Using atmospheric and room temperature plasma technique on screening high yield fidaxomicin strain[J].Chinese Journal of Antibiotics，2017，42（8）：643-646.

[9] 王一芩，閻永貞，胡兵，等.達托霉素高產菌株選育及發酵條件優化[J].中國抗生素雜志，2020，45（12）：1232-1237.

WANG Yiqin，YAN Yongzhen，HU Bing，et al.Breeding of high daptomycin producing strains and optimization of fermentation conditions[J].Chinese Journal of Antibiotics，2020，45（12）：1232-1237.

[10]張汝玲.克拉維酸高產菌的選育[J].河北工業科技，2011，28（3）：149-152.

ZHANG Ruling.Breeding of clavulani cacid mutant[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2011，28（3）：149-152.

[11]徐歡歡，張紅兵，李會宣，等.常壓室溫等離子體技術在微生物誘變中的應用進展[J].生物技術進展，2020，10（4）：358-362.

XU Huanhuan，ZHANG Hongbing，LI Huixuan，et al.Application progress of atmospheric and room temperature plasma technology in microbial mutagenesis[J].Current Biotechnology，2020，10（4）：358-362.

[12]李磊.小球藻（Chlorella vulgaris）UV、ARTP誘變育種及藻菌共生體系的構建[D].石家莊：河北經貿大學，2020.

LI Lei.Mutation Breeding of Chlorella Vulgaris by UV and ARTP and Construction of Symbiotic System of Algae and Bacteria[D].Shijiazhuang：Hebei University of Economics and Business，2020.

[13]肖志強，朱永明，李江華，等.高通量篩選高產維生素B12的誘變菌株——黏著劍菌[J].食品與發酵工業，2021，47（19）：7-11.

XIAO Zhiqiang，ZHU Yongming，LI Jianghua，et al.High-throughput screening of Ensifer adhaerens with improved vitamin B12 yield[J].Food and Fermentation Industries，2021，47（19）：7-11.

[14]張拴力，扈士海，王素欣，等.產乳酸鏈球菌素的乳酸乳球菌的等離子體誘變選育[J].河北科技大學學報，2015，36（6）：613-618.

ZHANG Shuanli，HU Shihai，WANG Suxin，et al.Plasma mutation breeding of Lactococcus lactis in producing Nisin[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2015，36（6）：613-618.

[15]汪杏莉，李宗偉，陳林海，等.工業微生物物理誘變育種技術的新進展[J].生物技術通報，2007（2）：114-118.

WANG Xingli，LI Zongwei，CHEN Linhai，et al.The development of physical mutation techniques in industrial microbe breeding [J].Biotechnology Bulletin，2007（2）：114-118.

[16]胡悅，李漢文，喻晨，等.LiCl-ARTP復合誘變選育高產堿性蛋白酶菌株及其發酵條件優化[J].中國釀造，2021，40（2）：59-65.

HU Yue，LI Hanwen，YU Chen，et al.Breeding of high yield alkaline protease strain by LiCl-ARTP compound mutation and fermentation condition optimization[J].China Brewing，2021，40（2）：59-65.

[17]黃玉，尼瑪扎西，薛正蓮，等.ARTP與紫外線復合誘變選育高性能綠僵菌菌株[J].食品工業科技，2021，42（4）：60-64.

HUANG Yu，Nimazhaxi，XUE Zhenglian，et al.Breeding of high performance Metarhizium anisopliae strain by ARTP/UV mutagenesis[J].Science and Technology of Food Industry，2021，42（4）：60-64.

[18]SHIMA J，HESKETH A，OKAMOTO S，et al.Induction of actinorhodin production by rpsL （encoding ribosomal protein S12） mutations that confer streptomycin resistance in Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolor A3（2）[J].Journal of Bacteriology，1996，178（24）：7276-7284.

[19]HOSOYA Y，OKAMOTO S，MURAMATSUH，et al.Acquisition of certain streptomycin-resistant （str） mutations enhances antibiotic production in bacteria[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1998，42（8）：2041-2047.

[20]魯鳳娟，侯燕燕，李曉廣，等.核糖體工程技術選育米爾貝霉素高產菌株[J].中國抗生素雜志，2018，43（7）：811-816.

LU Fengjuan，HOU Yanyan，LI Xiaoguang，et al.Breeding of high milbemycin-producing strain by ribosomal engineering[J].Chinese Journal of Antibiotics，2018，43（7）：811-816.

[21]李文華，黃永春，楊少彬，等.核糖體工程技術選育卡伍爾鏈霉菌高產菌株[J].中國農學通報，2017，33（7）：48-53.

LI Wenhua，HUANG Yongchun，YANG Shaobin，et al.Screening of high yield antibiotic producing strptomyces cavourensis strain by ribosome engineering technology[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2017，33（7）：48-53.