秸稈還田對棉田土壤養分和微生物多樣性的影響

秦新政，王玉苗，王志慧，謝成娟，王 博

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆師范大學生命科學學院，烏魯木齊 830054)

0 引 言

【研究意義】秸稈是一種天然可再生資源[1]，富含氮、磷、鉀等營養元素。隨著農業的發展，農作物秸稈數量增長迅速[2-3]，秸稈若被遺棄和焚燒，會造成環境污染和資源浪費[4-5]。秸稈還田可以避免資源浪費和環境污染[6]，也可以增加土壤養分[7]、調整土壤微生物群落結構，能提高土壤質量[8-9]，也是發展可持續農業的有效途徑[10]。秸稈還田形式多樣，包括粉碎后直接翻壓還田、覆蓋還田、堆漚還田和腐熟劑處理還田等，其中，秸稈粉碎后直接翻壓還田是當前秸稈肥料化利用的主要方式[11]。土壤微生物是土壤生態系統中極其重要和最為活躍的部分[12]，在土壤有機質形成和轉化、土壤養分循環等方面發揮重要作用[13-14]。土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質量和肥力的一個關鍵性指標[15]。研究秸稈還田方式下土壤微生物多樣性及群落結構演替規律，為秸稈資源有效利用提供理論依據，對改善土壤生態功能具有重要意義。【前人研究進展】棉稈中木質素含量較高，結構致密，還田后不易腐爛分解為土壤養分[16-18]。目前秸稈還田對農田土壤的影響已有很多研究結果，主要集中在秸稈還田對土壤的理化性質、酶活性、微生物群落結構變化以及農作物產量影響上。棉稈還田能夠提高沿海鹽堿地土壤養分，增加了土壤全氮、硝態氮、速效鉀含量[19]。【本研究切入點】秸稈還田是減少棉花廢棄物對環境污染的農業生產措施。目前秸稈直接還田對棉田土壤養分的深入研究報道較少。通過對棉稈還田后的降解、還田前后的土壤理化性質、可培養微生物數量和微生物多樣性。需要研究還田后棉花秸稈的降解及對土壤養分與微生物多樣性的影響。【擬解決的關鍵問題】以棉花秸稈粉碎還田后的土壤養分和土壤微生物為研究對象，分析棉花秸稈還田對棉田土壤養分和微生物多樣性的影響，為棉花秸稈還田在降低農業環境污染和提升土壤肥力方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗位于新疆農業科學院綜合試驗場(E：87.4643，N：43.9448)，研究區屬中溫帶大陸性干旱氣候，年平均降水量不足200 mm，年氣溫7.3℃，試驗點前茬作物為棉花。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

2020年開始試驗采用秸稈還田方式，共設置2個處理：傳統耕作(秸稈不還田+常規種植作為對照CK)，秸稈粉碎還田(CS)；將同一處理20袋秸稈樣品(25×35) cm，孔徑1 mm，每袋秸稈重量30 g左右，分成5組，每組4袋用細繩拴在一起。將5組樣品按5點梅花形均勻埋置于小區(5 m×5 m)，深度5～15 cm，均勻散開袋中秸稈，還田實驗期間未進行施肥及其他田間管理。棉花種植品種為棉雙豐500 NH12026。

1.2.2 樣品采集

土壤樣品：于2020年11月初棉花收獲后，2021年4月底棉花播種前，在處理樣地內隨機取樣。每個處理設5個土壤采樣點，去除土壤表層植株，采集0～20 cm土壤樣品，用無菌袋收集。將每個處理的樣品除去土壤中的根系、碎石及其他雜物，充分混勻后分成3份。土壤樣本采用干冰凍存，寄送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。用于土壤微生物量測定的樣品4℃保存，風干樣品用于測定土壤理化性質。

棉稈樣品：2020年11月初還田后采集對照棉稈樣品，并于120、160和180 d采集還田腐解后的棉稈樣品。

1.2.3 棉稈降解率

參照文獻[20]方法，將還田實驗所用的尼龍袋中的秸稈取出，沖洗干凈，80℃烘干至恒重。秸稈失重率以質量分數計，按式(1)計算每袋樣品的秸稈失重率：

Wx=(No-Nx)×100/No.

(1)

式中：

No：腐解前秸稈干重，g；

Nx：某腐解時間秸稈干重，g。

取5次測定結果的算術平均值作為測定結果，結果保留到小數點后2位。

1.2.4 土壤理化性質

參照文獻中的土壤檢測方法[21]測定土壤有機質、全氮、速效氮、速效鉀、速效磷、水溶性鹽總量、pH。

1.2.5 土壤微生物數量

對照土壤(CK)與還田處理土壤(CS)微生物菌落計數。稱取3 g土樣置于裝有30 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，在搖床上以240 r/min，振蕩30 min后靜置3 min；將土樣混懸液用無菌生理鹽水逐級稀釋，將稀釋液分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板、馬丁培養基平板、高氏一號培養基平板；細菌培養條件為37℃，培養48 h；真菌培養條件為25℃，培養6 d；放線菌培養條件為28℃，培養5 d；記錄不同類型培養基中觀察到的細菌、真菌、放線菌的菌落數量。

1.2.6 高通量測序

取0.5 g土樣，采用SPINeasy DNA Kit for Soi，MP Biomedicais DNA提取試劑盒(12888)提取土壤DNA。將純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈反應(PCR)的模板。采用細菌V3-V4區擴增引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′) /907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)，真菌ITS1區段擴增引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR采用25 μL反應體系：含10倍PCR buffer 5 μL，dNTP 0.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，Taq酶0.25 μL (250 U)，DNA模板1 μL，ddH2O補齊至25 μL。PCR反應條件：98℃預變性3 min，98℃15 s，50℃30 s和72℃30s，分別進行25個(細菌)和35個(真菌)循環，最后在72℃下延伸7 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，在Illumina MiSeq測序平臺上進行高通量測序分析。獲得原始序列后進行質量控制，之后在97%序列相似性水平上聚類成可操作的分類單元(Operational Taxonomic Units， OTUs)。對照RDP和UNITE數據庫進行分類注釋，獲取對應的細菌和真菌分類學信息。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS25.0對數據進行整理分析，方差分析采用最小顯著差異法(LSD)多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同還田時間下棉秸稈降解程度變化

研究表明，棉花秸稈的降解率隨著還田天數的增加而上升，處理180 d后，降解率最大可達5.01%。

秸稈還田后土壤速效氮、速效鉀含量顯著升高。秸稈還田前速效氮平均值為113.10 mg/kg，秸稈還田后速效氮平均值為121.48 mg/kg，提升了7.4%。秸稈還田前速效鉀的平均值為308.00 mg/kg，秸稈還田后速效鉀的平均值為408.93 mg/kg，提升了32.77%。表2

表1 不同還田時間下棉花秸稈降解程度變化Table 1 Change of degradation degree of cotton straw under different returning time

表2 不同秸稈還田下棉田土壤養分變化Table 2 Changes of soil nutrients in cotton field under different straw returning

2.2 秸稈還田對微生物數量的影響

研究表明，棉田土壤中可培養微生物總量提高9.8%，其中細菌數量提高64.6%，放線菌數量提高39.3%。表3

表3 不同秸稈還田下土壤主要微生物群落數量變化Table 3 Changes of soil microbial community quantity under different straw returning

2.3 秸稈還田對土壤微生物多樣性的影響

研究表明，秸稈還田后真菌的Chao1、Ace、Simpson指數降低，多樣性下降；而細菌的Chao1、Ace、Simpson指數升高，多樣性上升。表4，表5

表4 不同秸稈還田下土壤真菌多樣性變化Table 4 Diversity of soil fungi under different straw returning

表5 不同秸稈還田下土壤細菌群落多樣性變化Table 5 Changes of soil bacterial diversity under different straw returning

2.4 秸稈還田對土壤真菌群落組成的影響

2.4.1 土壤真菌TOP10 科群落結構對比

研究表明，秸稈還田處理后真菌群落在科水平上菌種類型有顯著變化，麥角菌科(Clavicipitaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)、粉褶菌科(Entolomataceae)、葡萄穗霉科(Stachybotryaceae)代替格孢菌科(Pleosporaceae)、沙漠殼菌科(Eremomycetaceae)、糞殼菌科(Hypocreales)、盤菌科(Helotiales)成為秸稈還田后的土壤真菌優勢菌群。其中秸稈還田后枝孢霉科(Cladosporiaceae)、赤殼科(Nectriaceae)、盤菌科(Helotiales)的相對豐度降低了48%、11%、10%；麥角菌科(Clavicipitaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)的相對豐度提高了28%、25%、13%，其中被孢霉科中有些物種可能與植物形成共生關系，這對改善土壤的結構性質、促進植物的生長起一定的作用，毛殼菌科中的生防菌可能對植物病原菌具有抑制效果。圖1

注：CK為對照處理；CS為秸稈還田處理；下圖相同。橫坐標/縱坐標為樣本名，縱坐標/橫坐標為物種在該樣本中所占的比例，不同顏色的柱子代表不同的物種，柱子的長短代表該物種所占比例的大小，下同

2.4.2 土壤真菌TOP10 屬群落結構對比

研究表明，秸稈還田土樣與對照土樣在真菌屬群落構成類型有顯著變化，優勢菌屬差異較大，綠僵菌菌屬(Metarhizium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、粉紅粘帚霉屬(Clonostachys)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、刺盤孢屬(Chordomyces)代替鏈格孢屬(Alternaria)、假埃希氏菌屬(Pseudallescheria)、匍柄霉屬(Stemphylium)、異莖點霉屬(Paraphoma)、粉紅螺旋聚孢霉屬(Clonostachys)成為秸稈還田后的土壤真菌優勢菌屬。其中被孢霉屬(Mortierella)、綠僵菌菌屬(Metarhizium)相對豐度提高了26%、29%，變化最為顯著，這與真菌科水平上的變化相對應。圖2

圖2 秸稈還田土壤真菌屬水平群落組成Fig.2 Community composition of Genus level of fungi in straw returning soil

2.4.3 土壤真菌TOP10 種群落結構對比

研究表明，對照土樣在種水平上最優勢的10個種分別是皺枝孢(Cladosporiumdelicatulum)、枝孢菌(Cladosporiumlimoniforme)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、甜菜黃萎病病原菌(Gibellulopsisnigrescens)、枝細枝孢菌(Cladosporiumramotenellum)、拉長被孢霉(Mortierellaelongata)、喜馬拉雅山維希尼克氏酵母(Vishniacozymaheimaeyensis)、緊密帚枝霉(Sarocladiumstrictum)、小囊菌(Microascusbrevicaulis)和Chordomycesantarcticus；

秸稈還田土樣在種水平上最優勢的10個種分別是南極被孢霉(Mortierellaantarctica)、糞生毛殼菌(Chaetomiumtruncatulum)、裂葉金孢霉(Chrysosporiumlobatum)、小孢擬棘殼孢(Pyrenochaetopsisdecipiens)、Cadophoramalorum、高山被孢霉(Mortierellaalpina)、甜菜黃萎病病原菌(Gibellulopsisnigrescens)、拉長被孢霉(Mortierellaelongata)、Chordomycesantarcticus。對照土樣與秸稈還田土樣在真菌種水平群落組成表現出極明顯差異。其中南極被孢霉(Mortierellaantarctica)、高山被孢霉(Mortierellaalpina)都屬于被枝孢霉屬，秸稈還田后相對豐度提高了17%、33%；皺枝孢菌(Cladosporiumdelicatulum)、枝孢菌(Cladosporiumlimoniforme)相對豐度分別降低了72%、13%，其它種類在還田前后變化差異不大。圖3

圖3 秸稈還田土壤真菌種水平群落組成Fig.3 Community composition of Species level of fungi in straw returning soil

2.5 秸稈還田對土壤細菌群落組成的影響

2.5.1 土壤細菌TOP10 科群落結構對比

研究表明，秸稈還田前后土壤細菌科群落結構中TOP10占總序列的百分比分別為20%、22.1%，并用相對含量作堆積圖。對照土樣與秸稈還田土樣在細菌科群落構成上類型有一定變化，芽孢桿菌科(Bacillaceae)、芽單胞菌科(Gemmatimonadaceae)、除硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)仍是優勢菌群，但芽孢桿菌科(Bacillaceae)與除硫單胞菌科(Desulfuromonadaceae)的相對豐度分別提高了6%、3%。秸稈還田后細菌科水平前10中新增加了鹽厭氧菌科(Halanaerobiaceae)、厭氧繩菌科(Anaerolineaceae)、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)，相對豐度分別為14%、8%、4%。秸稈還田后的新增加的硝化螺旋菌科對于氮素循環起著重要作用。圖4

圖4 秸稈還田土壤細菌科群落組成Fig.4 Community composition of Family level of bacteria in straw returning soil

2.5.2 土壤細菌TOP10 屬群落結構對比

研究表明，對照土樣與秸稈還田土樣在細菌屬群落構成類型有所差異，鹽胞菌屬(Halocella)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、半角藻屬(Haliangium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、梭狀桿菌屬(Clostridium)代替德沃斯氏菌屬(Devosia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、馬賽菌屬(Massilia)、固氮弓菌屬(Azoarcus)成為秸稈還田后的土壤細菌優勢菌屬。秸稈還田后芽孢桿菌屬仍是優勢菌屬，相對豐度增加了3%，鹽胞菌屬(Halocella)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)、半角藻屬(Haliangium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、梭狀桿菌屬(Clostridium)為新增加的前10菌屬，相對豐度分別為12%、10%、4%、4%、2%。圖5

圖5 秸稈還田土壤細菌屬群落組成Fig.5 Community composition of Genus level of bacteria in straw returning soil

2.5.3 土壤細菌TOP10 種群落結構對比

研究表明，對照土樣與秸稈還田土樣在細菌種群落構成上類型有所差異，農研所芽孢桿菌(Bacillusniabensis)、堿性桿菌(Bacillusalkalitelluris)、硒砷芽孢桿菌(Bacillusselenatarsenatis)、痤瘡丙酸桿菌(Halocellacellulosilytica)、產蛋白酶中度嗜鹽菌(Thalassobacillusdevorans)代替黏著劍菌(ensiferadhaerens)、地中海短波單胞菌(Brevundimonasmediterranea)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumelkanii)、米蘇里游動放線菌(Actinoplanesmissouriensis)、柯奈尼亞小單胞菌(Micromonosporachokoriensis)成為秸稈還田后的土壤細菌優勢菌屬。農研所芽孢桿菌(Bacillusniabensis)、堿性芽孢桿菌(Bacillusalkalitelluris)、硒砷芽孢桿菌(Bacillusselenatarsenatis)為秸稈還田后新增加的前10優勢菌種，相對豐度分別為16%、12%、11%。圖6

圖6 秸稈還田土壤細菌種水平群落組成Fig.6 Community composition of Species level of bacteria in straw returning soil

3 討 論

將秸稈直接粉碎回田仍是高效、直接且容易實現的方法[19]。研究測量了棉花秸稈在粉碎還田后的降解率，棉花秸稈的降解隨著還田天數的增加而上升，降解率最大可達5.01%。

在對鹽堿地進行棉稈還田的研究表明，還田顯著增加了0～20 cm土層各時期的全氮含量，不同秸稈還田方式均能改善土壤理化性質[21]。研究通過測定土壤理化性質對比發現，秸稈還田后土壤速效氮和速效鉀含量顯著增加，分別提高7.40%和32.77%。有研究發現，秸稈施加后會顯著增加水稻土壤速效鉀的含量[14]。

不同秸稈還田方式可增加農田殘茬、枯落物及植物根系分泌物，導致土壤碳、氮增加，土壤微生物可利用碳源增加，增加土壤微生物活性[25]，增強土壤微生物對碳水化合物、氨基酸、胺類化合物等碳源的利用能力[26]。秸稈還田配施有機肥與微生物有機肥能顯著提高土壤微生物的數量與活性，微生物群落結構也隨之發生變化，有利于土壤生態環境的改善，其中秸稈還田配施微生物有機肥效果最為顯著[15]。復合菌劑加上常規化肥處理能夠加速秸稈養分還田、改善土壤理化狀況，增強微生物活性[25]。土壤微生物在秸稈降解和營養元素釋放過程中起著關鍵作用，同時秸稈還田方式、還田數量也會對土壤微生物產生較大的影響。通過微生物群落碳源利用的主成分分析表明，秸稈層能有效滯留氮素，減少土壤氮素淋失，增加土壤微生物群落功能多樣性[26]。

棉花秸桿還田使土壤中可培養微生物總量提高9.8%，細菌數量提高64.6%，放線菌數量提高39.3%；秸稈還田對土壤微生物多樣性有顯著影響，在科、屬、種層面的微生物菌群結構都發生了變化。尤其是真菌的群落結構變化顯著，麥角菌科(Clavicipitaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)的相對豐度提高了28%、25%、13%，其中被孢霉科中有些物種可能與植物形成共生關系，對改善土壤的結構性質、促進植物的生長起一定的作用，毛殼菌科中的生防菌可能對植物病原菌具有抑制效果。其中被孢霉屬(Mortierella)、綠僵菌菌屬(Metarhizium)相對豐度提高了26%、29%，變化最為顯著，與真菌科水平上的變化相對應。綠僵菌菌屬為麥角菌科，是一類重要的生防真菌，可寄生多種昆蟲，在生產中已得到廣泛的應用。

4 結 論

秸稈還田能夠增加棉田土壤養分和可培養微生物的數量，秸稈還田后土壤速效氮和速效鉀含量顯著增加，分別提高7.40%和32.77%；土壤可培養微生物總量提高9.8%，其中細菌數量提高64.6%，放線菌數量提高39.3%；秸稈還田對土壤微生物多樣性有顯著影響。