小綠葉止咳糖漿主要化合物鑒定及藥物移行成分分析

劉匡一， 熊國營， 蘇 丹

(1.南昌市第一醫(yī)院藥劑科，江西 南昌 330000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)抑郁癥中醫(yī)證候動物模型江西省中醫(yī)藥管理局重點研究室，江西 南昌 330000)

小綠葉止咳糖漿是德國Engelhard公司開發(fā)出的純天然藥物，主要成分是常春藤葉干提取物，用于緩解小兒感冒等各種病因引起的咳嗽和咽喉腫脹，能有效對抗可能轉(zhuǎn)化的嚴(yán)重支氣管炎，其療效在臨床上得到肯定。但課題組前期查閱國內(nèi)外相關(guān)資料及說明書，未見對小綠葉止咳糖漿中常春藤葉提取物主要成分的報道，而該制劑成分組成的不確定性會嚴(yán)重制約其臨床應(yīng)用。同時，標(biāo)志性活性成分的確定作為中藥質(zhì)量控制的核心環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)，貫穿了整個質(zhì)量傳遞體系[1]，故尋找小綠葉止咳糖漿主要成分顯得更為重要。

研究表明，常春藤屬植物的種類較多，在全世界共有14種，大多以生長地區(qū)來命名，如加納利常春藤、英國常春藤、中華常春藤、臺灣常春藤等[2]，目前對小綠葉止咳糖漿中常春藤的種屬未知，主要成分可能為皂苷、黃酮等[3-4]。本實驗采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-QTOF/MS)儀中的Swath采集技術(shù)[5-7]，鑒定小綠葉止咳糖漿中主要化合物，并分析該制劑藥物移行成分，以期為其物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)，也為后續(xù)相關(guān)質(zhì)量評價與控制奠定基礎(chǔ)[8]。

1 材料

1.1 儀器 超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；SCIEX 6600+四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(美國SCIEX公司)；TC-16G高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；VORTEX-6渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；AL104電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DCY-24S恒溫氮氣吹干儀(青島海科儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 木犀草苷(批號111720-201307，純度≥94.0%)、槲皮苷(批號111538-200301，純度≥94.5%)、綠原酸(批號110753-201415，純度≥96.2%)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；白頭翁皂苷B4(批號Z01M8S30248，純度≥98.0%)對照品購于上海源葉生物科技有限公司。小綠葉止咳糖漿(批號19F059A)購于網(wǎng)絡(luò)平臺天貓國際自營店。甲醇、乙腈為色譜純，均購于美國Thermo Fisher公司；甲酸為色譜純，購于美國Sigma公司；水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 動物 SPF級雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量(180±20)g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(贛)2018-003。

2 方法

2.1 供試品溶液、藥液制備 取1 mL本品，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，50%乙腈定容至刻度，超聲提取30 min，50%乙腈補足減失的質(zhì)量，16 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。取100 mL至蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴蒸干至10 mL左右，即得藥液，在4 ℃下冷藏保存。

2.2 對照品溶液制備 取木犀草苷、槲皮苷、綠原酸、白頭翁皂苷B4對照品適量，乙腈溶解稀釋，即得(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，在4 ℃下冷藏保存。

2.3 分組與給藥 6只大鼠正常喂養(yǎng)1周，給藥前禁食12 h，自由飲水，隨機分為空白組、給藥組，每組3只，空白組大鼠灌胃給予2 mL生理鹽水，給藥組大鼠灌胃給予2 mL“2.1”項下藥液，于0、0.5、1、2、4 h眼眶取血各0.5 mL左右，置于肝素鈉抗凝處理的離心管中，4 000 r/min離心5 min，取上清液，在-20 ℃下保存，4 h后取大鼠肺部組織，生理鹽水沖洗，洗凈后加入2倍量生理鹽水，置于勻漿機上勻漿后4 000 r/min離心5 min，取上清液，在-20 ℃下保存。

2.4 血漿、肺組織處理 取大鼠血漿、肺組織勻漿上清液各200 μL，600 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋振蕩2 min，16 000 r/min離心10 min，取上清液，室溫氮氣恒流吹干，200 μL乙腈復(fù)溶。

2.5 色譜條件 Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流動相正離子模式0.05%甲酸(A)-乙腈(B)，負(fù)離子模式水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1.5 min，5%B；1.5～5 min，5%～20%B；5～15 min，20%～40%B；15～35 min，40%～65%B；35～39 min，65%～90%B；39～42 min，90%B；42～42.1 min，90%～5%B;42.1～47 min，5%B)；體積流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。

2.6 質(zhì)譜條件 SCIEX Triple TOF 6600+質(zhì)譜儀；電噴霧離子源，正負(fù)離子掃描模式；正離子電壓5 500 V，負(fù)離子電壓-4 500 V；Gas 1/Gas 2 50 psi(1 psi=6.895 kPa)；Cur Gas 35 psi；一級TOF MS掃描范圍m/z100～1 500，DP 60 V；二級采用Swath MS/MS非數(shù)據(jù)依賴型模式進行數(shù)據(jù)采集，正離子模式下碰撞能量45 V，負(fù)離子模式下碰撞能量55 V，MS/MS掃描范圍m/z50～1 500。整體掃描模式中的數(shù)據(jù)采集在動態(tài)背景扣除模式下運行。

2.7 數(shù)據(jù)處理 通過SCIEX OS 2.0軟件進行處理，分析樣品色譜圖信息，鑒定主要化合物和藥物移行成分。

3 結(jié)果

3.1 主要化合物 UPLC-QTOF/MS總離子流圖見圖1，通過對照品比對確定木犀草苷、槲皮苷、綠原酸、白頭翁B4皂苷出峰情況，并通過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)[9-24]，結(jié)合天然產(chǎn)物質(zhì)譜裂解規(guī)律鑒定出62個主要化合物，包括酚苷、植物激素各1個，萜類3個，氨基酸、有機酸各5個，香豆素3個，黃酮7個，皂苷34個，具體見表1。

圖1 小綠葉止咳糖漿UPLC-QTOF/MS總離子流圖Fig.1 UPLC-QTOF/MS total ion current chromatograms of Prospan Hustenliquid Cough Syrup

3.2 酚苷結(jié)構(gòu)解析 本實驗鑒定出的酚苷為根皮酚(-β-D-葡萄糖苷)，正離子掃描模式下在保留時間3.88 min處存在一級母離子m/z289.092 1[M+H]+、二級碎片離子m/z127.039 6[M-C6H11O5+H]+，并且m/z109.025 1為m/z127.039 6[M-C6H11O5+H]+再掉一分子水所致。

3.3 有機酸結(jié)構(gòu)解析 本實驗共鑒定出5種有機酸，在負(fù)離子檢測模式下分別為保留時間1.05、4.56、5.56、5.76、25.88 min處的奎寧酸(m/z191.055 7[M-H]-)、新綠原酸(m/z353.087 3[M-H]-)、綠原酸(m/z353.087 2[M-H]-)、隱綠原酸(m/z353.087 7[M-H]-)、lyofolic acid(m/z693.418 8[M-H]-)。通過對照品比對確定綠原酸保留時間，并且新綠原酸、隱綠原酸與綠原酸互為同分異構(gòu)體，再比較三者logP，確定其出峰順序為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸，以新綠原酸為例，其裂解途徑見圖2。

3.4 香豆素結(jié)構(gòu)解析 結(jié)合天然產(chǎn)物裂解規(guī)律和數(shù)據(jù)信息，本實驗在正離子掃描模式下鑒定出3種香豆素，分別為保留時間4.83、5.99、6.42 min處的秦皮甲素(m/z341.086 2[M+H]+)、秦皮乙素(m/z179.034 0[M+H]+)、4-甲基傘形酮-α-D-吡喃半乳糖苷(m/z339.107 1[M+H]+)。以4-甲基傘形酮-α-D-吡喃半乳糖苷為例，其一級離子中母離子以m/z339.107 1[M+H]+模式存在，二級碎片m/z147.044 1為一級母離子脫去一分子葡萄糖基、一分子水、一分子甲基所致。另外，秦皮甲素二級碎片中m/z179.033 9為[M-C6H11O5+H]+所得。

注：虛線為斷鍵方式。圖2 新綠原酸二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.2 MS/MS spectrum and fragmentation pathway for neochlorogenic acid

3.5 黃酮結(jié)構(gòu)解析 通過文獻(xiàn)檢索和天然產(chǎn)物裂解規(guī)律，結(jié)合數(shù)據(jù)處理軟件中的Formula Finder確證方式，在正離子掃描模式下鑒定出以[M+H]+模式存在的槲皮苷、金絲桃苷、桑色素、蘆丁、3,3′,4′,7-四羥基黃酮、木犀草苷(對照品比對)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷。在常春藤屬植物中，黃酮一般有帶有糖基類基團，故其二級碎片中都存在失去糖基的二級離子，例如保留時間8.50 min處的m/z449.105 8[M+H]+槲皮苷二級離子中含m/z287.055 0[M-C6H11O5+H]+的掉糖基碎片離子，金絲桃苷二級碎片離子包括失去一分子葡萄糖基的m/z303.049 9及經(jīng)RDA等裂解反應(yīng)得到的m/z85.028 4碎片離子。綜上所述，藥液中黃酮普遍存在RDA裂解反應(yīng)，m/z303.049 9、85.028 4的碎片離子是蘆丁、金絲桃苷共有特征碎片離子，而m/z153.018 1是桑色素、3,3′,4′,7-四羥基黃酮特征碎片離子。

表1 小綠葉止咳糖漿藥液主要化合物

續(xù)表1

3.6 皂苷結(jié)構(gòu)解析 皂苷作為常春藤主要有效成分，其苷元主要為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，形式以鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖為主。在鑒定過程中，本實驗按照特征碎片及中性丟失的方式來快速尋找化合物，如正離子模式下易產(chǎn)生m/z455.350 6、437.337 5的特征碎片離子，而負(fù)離子模式下易產(chǎn)生m/z603.392 6、469.157 0、367.123 7的特征碎片離子。

結(jié)果，共鑒定出34種皂苷，包括正離子模式下的續(xù)斷皂苷K、白頭翁皂苷A3、遼東楤木皂苷Ⅶ等，以及負(fù)離子模式下的野木瓜糖苷A、α-常春藤皂苷、常春藤皂苷B、川續(xù)斷皂苷Ⅵ等。以保留時間24.82 min處的假馬齒莧皂苷N1為例，離子模式m/z795.451 6[M-H]-，其裂解途徑見圖3。另外，保留時間18.10 min處的成分推測為常春藤皂苷B，通過對一級離子m/z1 203.630 5[M-H]-的碰撞能量給予，得到失去兩分子葡萄糖基、一分子鼠李糖基的碎片離子m/z733.452 2，其裂解途徑見圖4。

注：虛線為斷鍵方式。圖3 假馬齒莧皂苷N1二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.3 MS/MS spectrum and fragmentation pathway for bacopaside N1

注：虛線為斷鍵方式。圖4 常春藤皂苷B二級質(zhì)譜圖及裂解途徑Fig.4 MS/MS spectrum and fragmentation pathway for hederasaponin B

3.7 藥物移行成分 通過色譜圖、碎片離子信息，本實驗共發(fā)現(xiàn)32種藥物移行成分，其中皂苷含量較高，同時檢測出5種單獨入肺成分，分別為槲皮苷、木犀草苷、三羥基齊墩果酸、羅漢松脂素、川續(xù)斷皂苷Ⅵ。結(jié)合Sciex QTOF中的Swath非數(shù)據(jù)依賴型采集技術(shù)，選擇目標(biāo)化合物中MS/MS響應(yīng)強度較大的二級碎片離子，形成MRMHR(High Resolution)通道后進行定量研究，發(fā)現(xiàn)大部分入血皂苷在1 h左右的含量達(dá)到最高，4 h后普遍降低為最低；入肺成分含量較高，并明顯高于入血成分的最高值。見圖5。

圖5 藥物移行成分含量分布熱圖(n=3)Fig.5 Heatmap for content distribution of drug transitional components (n=3)

4 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，小綠葉止咳糖漿主要化學(xué)成分中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量最高，其次為皂苷類成分(假馬齒莧皂苷N1、HN-saponin E、白頭翁皂苷B4、常春藤皂苷B/C)，其中綠原酸類成分具有較強的抗氧化、抗菌、抗炎、解熱、抗病毒等藥理活性[14-15]，而皂苷類成分也普遍存在抗炎、祛痰、止咳功效[16-18]。因此，小綠葉止咳糖漿用于治療咳嗽、預(yù)防支氣管炎是具有科學(xué)依據(jù)。

定量分析結(jié)果表明，部分黃酮、皂苷類成分入血含量較高，以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、金絲桃苷、白頭翁皂苷B4、假馬齒莧皂苷N1、常春藤皂苷C為代表，整體入血分布與小綠葉止咳糖漿主要成分含量基本一致；4 h后，大部分成分在大鼠血漿中處于消除狀況，符合皂苷、黃酮類藥動學(xué)消除特性[19-21]；大鼠肺組織中各成分含量較高，蓄積程度大于血漿，進一步驗證該制劑對呼吸道疾病的治療作用。另外，與空白大鼠比較，給藥后大鼠血漿和肺組織中L-酪氨酸、鳥嘌呤、腺苷類成分含量差異較大，體內(nèi)作用時間較久，并且2 h后存在再次吸收現(xiàn)象，可能是由于上述成分進入機體后可調(diào)控生物體相關(guān)的代謝通路，使該類內(nèi)源性物質(zhì)在整個血漿表達(dá)方面呈現(xiàn)二次升高。

綜上所述，本實驗采用UPLC-QTOF/MS法鑒定了小綠葉止咳糖漿中62個主要化合物，同時檢測出大鼠血漿和肺組織中32種藥物移行成分，可為該制劑后續(xù)質(zhì)量評價中Q-Marker的確定奠定基礎(chǔ)，也能為其臨床合理利用提供依據(jù)。