蒿竭通痹氣霧劑制備工藝的優化

李 江， 張 希， 彭 霜， 郭媛媛， 楊 唯， 陳凌云， 李紹榮*， 余曉玲*

(1.昆明市中醫醫院，云南 昆明 650500；2.云南中醫藥大學，云南省高校外用給藥系統與制劑技術研究重點實驗室，云南 昆明 650500；3.普洱市民族傳統醫藥研究所，云南 普洱 665000)

蒿竭通痹方由雪上一枝蒿、馬錢子、龍血竭、紅花、細辛組成，具有活血止痛、祛風散寒、除濕通痹、消腫通絡之功效，用于治療風寒濕熱、淤血阻滯所致的關節疼痛，該方以白酒浸漬2周后制成酒劑，外用時以手涂抹藥液，按摩患處，但方中雪上一枝蒿、馬錢子毒性藥材，使用時可能由于附著于手而隨飲食入口，而且酒劑生產、保存、攜帶、運輸、給藥均存在不便。因此，本實驗結合藥味特性和臨床需求，將蒿竭通痹方開發成攜帶方便、質量穩定的氣霧劑，并對該制劑制備工藝進行優化，以期為其臨床推廣奠定基礎，也為其他中藥復方酒劑改制成氣霧劑提供了新的方法和思路。

1 材料

安捷倫1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；CP124C電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]。雪上一枝蒿甲素(批號110895-200404)、馬錢子堿(批號110706-200505)、士的寧(批號110705-20030)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。雪上一枝蒿(批號X18041910)、馬錢子(批號M18062001)、紅花(批號H18030701)、細辛(批號XX18031401)、龍血竭(批號L18062006)均由昆明市中醫醫院提供，有檢驗合格報告。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取工藝優化

2.1.1 原料藥含量測定

2.1.1.1 雪上一枝蒿甲素 精密稱取80 ℃下干燥至恒重的對照品適量，甲醇制成100 μg/mL對照品溶液；取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，加1 mL濃氨試液，密封，浸漬30 min，加25 mL甲醇，稱定質量，超聲提取1 h(53 kHz，100 W)，甲醇補足減失的質量，濾過，取10 mL續濾液，蒸干，甲醇溶解，定容至5 mL，作為供試品溶液。

色譜條件[1]為Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-[0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 ml/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(10%磷酸調節pH至2.8)](17∶83)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL，發現雪上一枝蒿甲素色譜峰與附近雜質峰分離度良好，理論塔板數不低于2 000。

以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=3.32X+2.66(r=0.999 7)，在16.50～264.00 μg/mL范圍內線性關系良好。精密度試驗中，雪上一枝蒿甲素峰面積RSD為0.79%(n=6)，表明儀器精密度良好。穩定性試驗中，對照品、供試品溶液中雪上一枝蒿甲素峰面積RSD分別為0.80%、0.33%，表明溶液在0、4、8、12 h內穩定性良好。重復性試驗中，雪上一枝蒿甲素含量RSD為1.22%(n=6)，表明該方法重復性良好。取6份雪上一枝蒿甲素含量已知(4.91 μg/mL)的同一批藥材，加入281.00 μg/mL對照品溶液4 mL，制備供試品溶液，測得該成分平均加樣回收率為101.19%，RSD為2.35%。取藥材(批號X18041910)4份，測得雪上一枝蒿甲素平均含量為6.19 mg/g(RSD=0.13%)。

2.1.1.2 馬錢子堿、士的寧 取藥材(批號M18062001)4份，按2020年版《中國藥典》方法測定，得馬錢子堿、士的寧平均含量分別為19.26、20.59 mg/g，RSD分別為0.09%、0.18%。

2.1.2 提取液含量測定

2.1.2.1 溶液制備 精密稱取雪上一枝蒿甲素(在80 ℃下干燥至恒重)、馬錢子堿、士的寧對照品適量，甲醇制成質量濃度分別為100、200、200 μg/mL的對照品溶液。按處方比例取1/5量的藥材共12 g，乙醇提取后合并醇提液，定容(提取1、2、3次時定容至500 mL，4次時定容至1 000 mL)，濾過，作為供試品溶液，同法分別制備缺雪上一枝蒿、缺馬錢子的陰性樣品溶液。

2.1.2.2 色譜條件與系統適用性試驗 Diamonsil C18色譜柱；流動相乙腈(A)-[0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 ml/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(10%磷酸調節pH至2.8)](B)，梯度洗脫(0～13 min，16.5%A；13～15 min，16.5%～24.0%A)；體積流量1.3 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長210 nm(雪上一枝蒿甲素)、265 nm(馬錢子堿)、255 nm(士的寧)；進樣量10 μL，色譜圖見圖1。由此可知，各成分分離度良好(均不小于1.97)，理論塔板數按雪上一枝蒿甲素計不低于1 500，陰性無干擾。

1. 雪上一支蒿甲素 2. 馬錢子堿 3. 士的寧1. bullatine A 2. brucine 3. strychnine圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2.3 方法學考察 取對照品溶液2.5 mL(雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧質量濃度分別為238.40、464.92、459.39 μg/mL)，甲醇定容至5 mL，取2.5 mL，甲醇定容至5 mL，按上述比例反復稀釋，在“2.1.2.2”項色譜條件下進樣測定，以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧方程分別為Y=17.16X+31.60(r=0.999 9)、Y=8.30X+22.24(r=0.999 9)、Y=3.62X+10.81(r=0.999 4)，分別在14.90～238.40、29.06～464.92、28.72～459.39 μg/mL范圍內線性關系良好。精密度試驗中，3種成分峰面積RSD分別為1.64%，1.69%，0.64%(n=6)，表明儀器精密度良好。穩定性試驗中，對照品溶液中3種成分峰面積RSD分別為1.68%、1.16%、0.88%，供試品溶液中分別為1.55%、0.50%、0.87%，表明溶液在0、4、8、12 h內穩定性良好。重復性試驗中，3種成分含量RSD分別為2.02%、2.20%、1.45%(n=6)，表明該方法重復性良好。取6份3種成分含量已知(分別為33.48、103.97、102.56 μg/mL)同一批提取液，加入對照品溶液(3種成分質量濃度分別200.20、630.83、431.26 μg/mL)1 mL，按“2.1.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.2.2”項色譜條件下進樣測定，測得3種成分平均加樣回收率分別為96.78%、100.31%、98.52%，RSD分別為1.94%、2.54%、2.34%。

2.1.3 單因素試驗

2.1.3.1 轉移率、綜合評分 以雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧轉移率及浸膏得率為評價指標[2]，進行單因素試驗，計算公式為轉移率=(1 g藥材提取液中相應成分含量/1 g藥材中相應成分含量)×100%[3]，再計算綜合評分Z1，公式為Z1=[(雪上一枝蒿甲素轉移率/最大值)×0.25+(馬錢子堿轉移率/最大值)×0.25+(士的寧轉移率/最大值)×0.25+(干膏得率/最大值)×0.25]×100。

2.1.3.2 粉碎粒徑、提取方法、乙醇體積分數 參考文獻[4]報道，采用單因素試驗對粉碎粒徑(飲片、80%過1號篩同時過2號篩的不超過30%、80%過4號篩同時過6號篩的不超過30%)、提取方法[固定乙醇體積分數為55%，回流提取條件為提取3次，第1次料液比1∶10提取3 h，第2次料液比1∶8提取2 h，第3次料液比1∶5提取1 h；超聲提取條件為53 kHz、100 W提取2次，料液比1∶10，提取時間1 h；浸漬提取條件為浸漬3次，料液比1∶8，浸漬時間1周；滲漉提取條件為料液比1∶8浸漬12 h后按1∶15比例滲漉提取，體積流量0.25 mL/(12 g·min)]、乙醇體積分數(35%、45%、55%、65%、75%)進行考察。結果，篩選出最優粉碎粒徑為80%過1號篩同時過2號篩的不超過30%，提取方法為回流提取，乙醇體積分數為55%。

2.1.3.3 浸泡時間、吸液量 組方藥材按“2.1.3.2”項下規格粉碎，稱取6份，每份12 g，55%乙醇(料液比1∶10)浸漬，每15 min取1份樣品，濾盡浸漬液，稱定藥渣質量，平行操作2次，測得最佳吸液量為(64.52±1.90)%，浸泡時間為60 min。吸液量計算公式為吸液量=(浸漬后藥渣質量/浸漬前藥渣質量)×100%。

2.1.3.4 料液比、提取時間、提取次數 采用單因素試驗對料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)、提取時間(20、40、60、80、100 min)、提取次數(1、2、3)進行考察。結果，最優料液比為1∶12，提取時間為60 min，提取次數為2次。

2.1.4 AHP-CRITIC法結合Box-Behnken設計

2.1.4.3 AHP-CRITIC混合加權法 按公式Wf=Wj-AHPWj-CRITIC/∑Wj-AHPWj-CRITIC，計算雪上一枝蒿甲素轉移率、馬錢子堿轉移率、士的寧轉移率、浸膏得率復合權重系數(Wf)測得四者分別為0.155、0.286、0.336、0.223。采用SPSS 18.0軟件對AHP與CRITIC的復合權重系數進行相關性分析，測得相關系數為-0.969，表明2種賦權方法存在較大差異，無疊加性。再對Box-Behnken設計中AHP、CRITIC、AHP- CRITIC法所得綜合評分進行相關性分析，發現AHP與CRITIC、AHP與AHP-CRITIC、CRITIC與AHP-CRITIC的相關系數分別為0.960、0.997、0.977，表明3種賦權方法具有一致性，所得復合權重系數可靠。

表1 CRITIC法計算各指標相關參數

表2 Box-Behnken設計結果

2.1.5 驗證試驗 采用小試工藝規模，取標準處方量藥材共100 g，按“2.1.4”項下優化工藝進行3批驗證試驗。測得平均綜合評分為102.97分(RSD=3.47%)，與預測值99.28分接近(相對誤差為3.72%)，表明該工藝穩定可靠。

2.2 濃縮工藝優化 以雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧保留率為評價指標，采用單因素試驗優化濃縮工藝。結果，最優工藝為先在(65±5)℃、(0.06±0.01)MPa下將提取液濃縮至1 mL/0.1 g原藥材，再在常壓下濃縮至1 g/3 g原藥材，各成分平均保留率為79.94%(n=2)。

2.3 成型工藝優化

2.3.1 單因素試驗 以雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧保留率為評價指標，對乙醇體積分數(70%、80%、85%、90%、95%)進行考察，確定為90%乙醇。參考文獻[13]報道，以沉淀、分層、拋射劑與藥液相溶性，噴射狀態為評價指標，對拋射劑種類及用量(固定藥液30 mL，分別與15、21、27、33 g四氟乙烷、丙丁烷、異丁烷構成12個組合)，附加劑種類及用量(固定藥液30 mL，組合見表3)進行考察，確定為丙丁烷用量為21～27 g，甘油用量為3 g，丙二醇用量為1～1.5 g。

2.3.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以丙丁烷用量(A2)、甘油用量(B2)、丙二醇用量(C2)為影響因素，評價指標見表4，采用正交試驗作進一步優化，結果見表5，最終確定最優工藝為藥液用量30 mL，丙丁烷用量21 g，甘油用量3 g，丙二醇用量1.5 g，綜合評分為95分，方差分析見表6，可知丙丁烷用量有顯著影響(P<0.05)。再按上述優化工藝進行3批驗證試驗[14]，測得平均綜合評分為94分，與預測值95分接近，表明該工藝穩定可靠。

表3 成型工藝單因素試驗水平

表4 成型工藝評分標準

表5 正交試驗設計與結果

表6 方差分析

3 討論

課題組前期對蒿竭通痹方中雪上一枝蒿、馬錢子2味君藥和貴細藥材龍血竭(不參與提取，在配液時用95%乙醇溶解后與其余藥材提取物混合)進行質量標準研究，并起草了相關草案。為了保障制備工藝研究的可靠性，本實驗所用藥材均為同一批次，并且均符合上述要求。

在提取工藝優化過程中，本實驗選擇雪上一枝蒿甲素、馬錢子堿、士的寧轉移率作為評價指標，這3種成分均具有抗炎、抗菌、鎮痛功效[15-16]，與蒿竭通痹方臨床適應癥相關；原方采用白酒浸漬后入藥，故直接選擇乙醇作為提取溶劑；浸膏得率作為另1個評價指標，由于在單因素試驗中無法計算混合權重系數，故上述4個指標的權重系數均設為0.25。再采用AHP-CRITIC混合加權法進行賦權，該方法與單一的Delphi賦權、AHP賦權、CRITIC賦權比較具有更高的可靠性。

在成型工藝優化過程中，本實驗以沉淀、分層情況為主要評價指標，同時結合2020年版《中國藥典》四部通則0113對于非定量外用氣霧劑的要求，選擇噴射速率、噴出總量、內壓作為次要評價指標，并對上述指標的得分標準進行具體劃分，再結合正交設驗，可使所選處方更合理。

綜上所述，AHP-CRITIC混合加權法結合Box-Behnken試驗可使蒿竭通痹方提取工藝研究更合理，而在該方成型工藝優化過程中評分標準結合正交試驗能更高效可靠地篩選處方。