女貞子多糖對IL-1β誘導的關節軟骨細胞損傷和炎癥反應的作用

張安琪， 鄭福增， 周子朋， 趙晶晶， 袁都戶

(1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，河南 鄭州 450000；2.河南省中醫院風濕科，河南 鄭州 450000)

骨關節炎是全球最普遍的老年常發的慢性關節疾病，發病率逐年上升，軟骨細胞凋亡及炎癥反應與其發病機制密切相關[1-2]。中藥治療骨關節炎具有獨特優勢，可抑制炎癥相關因子的分泌，改善軟骨基質合成及分解代謝失衡，抑制軟骨細胞凋亡等[3-4]。女貞子含有多糖、黃酮類、三萜類等成分，其中多糖含量最高，具有免疫調節和抗氧化的作用[5-6]，其提取物可通過抑制軟骨細胞肥大干預大鼠膝骨關節炎疼痛[7]；多糖對脂多糖誘導的大鼠睪丸支持細胞炎性損傷具有保護作用[8]，但該成分對關節軟骨細胞的凋亡和炎癥反應的影響及機制尚不明確。

研究表明，非編碼RNA(包括lncRNA、miRNA和circRNA)在軟骨細胞凋亡及骨關節炎的發生發展中起潛在作用[9]，在原發性膝關節骨關節炎的軟骨組織及細胞中，miR-145呈低表達[10]，它可通過靶向抑制Bcl2相互作用蛋白3(BNIP3)和調節Notch信號通路來減少骨關節炎中軟骨細胞的凋亡[11]。課題組前期發現，miR-145與circ_0039411有結合位點，并且沉默circ_0039411可以阻止氧化釹引起的支氣管上皮細胞炎癥，炎癥反應的發生[12]，但其對關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應的影響尚不明確。本實驗旨在研究女貞子多糖對關節軟骨細胞的凋亡和炎癥反應的影響，并考察其機制是否與circ_0039411和miR-145有關，以期為骨關節炎發病機理及防治研究提供新的理論基礎。

1 材料

1.1 細胞 人關節軟骨細胞，購自上海博湖生物科技有限公司。

1.2 試劑與藥物 女貞子多糖(批號20200104)購自四川省維克奇生物科技有限公司。DMEM培養液(批號20190204)購自美國HyClone公司；白細胞介素-1β(interleukin，IL-1β)(批號20200603)購自上海滬震生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT)試劑盒(批號20200509)購自上海彩佑實業有限公司；凋亡檢測試劑盒(批號20200607)購自北京沃凱生物科技有限公司；總蛋白提取試劑盒(批號20200308)購自武漢純度生物科技有限公司；IL-8、IL-6、IL-10酶聯免疫吸附試劑盒(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)(批號20201002、20200906、20200922)購自上海美軒生物科技有限公司；熒光定量試劑盒(批號20200507)購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(批號20201019)購自上海澤葉生物科技有限公司。

2 方法

2.1 分組 人關節軟骨細胞用DMEM培養液培養，將其分為對照組、模型組及女貞子多糖低、中、高劑量組，對照組不作任何處理，模型組用50 ng/mL IL-1β處理，女貞子多糖低、中、高劑量組分別用50、200、800 μg/mL女貞子多糖和50 ng/mL IL-1β處理。將circ_0039411干擾表達質粒及陰性對照，miR-145模擬物及陰性對照轉染至軟骨細胞，再用50 ng/mL IL-1β處理，作為si-circ_0039411組、si-NC組、miR-145組、miR-NC組；將circ_0039411過表達載體質粒及miR-145抑制表達質粒染至軟骨細胞，再用800 μg/mL女貞子多糖和50 ng/mL IL-1β處理，作為女貞子多糖+pcDNA-circ_0039411組、女貞子多糖+anti-miR-145組。

2.2 MTT法檢測軟骨細胞增殖活性 細胞按“2.1”項下方法分組培養48 h，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續培養4 h后棄去培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，采用酶標儀檢測490 nm波長處光密度(OD)來表示細胞相對活力。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞按“2.1”項下方法分組培養48 h，離心收集，PBS漂洗后制成單細胞懸液，加入500 μL緩沖液，混勻后加入Annexin V-FITC、PI各10 μL，混勻后避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

2.4 Western blot法檢測細胞蛋白表達 細胞按“2.1”項下方法分組培養48 h，離心收集，提取總蛋白，煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳，90 V 30 min后改成120 V 2 h，濕轉法移至PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，將膜放入含有一抗的雜交袋中，在37 ℃下孵育2 h，將PVDF膜放入含二抗的雜交袋中，室溫孵育2 h，ECL發光顯影，定影成像后檢測蛋白條帶的灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達。

2.5 ELISA法檢測細胞上清液IL-8、IL-6、IL-10水平 細胞按“2.1”項下方法分組培養48 h，離心收集細胞上清液，按照試劑盒說明操作，檢測細胞上清液IL-8、IL-6、IL-10水平。

2.6 RT-qPCR法檢測細胞circ_0039411、miR-145表達 細胞按“2.1”項下方法分組培養48 h，離心收集，提取總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行RT-qPCR反應，反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達。引物序列為circ_0039411正向5′-GGCACTTTTCACGTGTCACC-3′，反向5′-GTGAA GGGGAAGACACAGGG-3′；miR-145正向5′-GGATTCCTGGAAATACUGTTCT-3′，反向5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTC-3′；內參GAPDH正向5′-CCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向5′-CGTTCAG CTCAGGGATGAC-3′；內參U6正向5′-CTCGCT TCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGAAT TTGCGT-3′。

2.7 雙熒光素酶報告實驗 構建circ_0039411野生型和突變型熒光素酶載體WT-circ_0039411、MUT-circ_0039411，將其分別與miR-NC、miR-145共轉染至軟骨細胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性。

3 結果

3.1 女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響 由圖1、表1可知，與對照組比較，模型組軟骨細胞活性降低，細胞凋亡率升高，Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，女貞子多糖各劑量組軟骨細胞活性升高，細胞凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。

注：1～5分別為對照組，模型組，女貞子多糖低、中、高劑量組。A為各組細胞凋亡情況，B為各組細胞凋亡相關蛋白表達。圖1 女貞子多糖對軟骨細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of L. lucidum polysaccharide on chondrocyte apoptosis

表1 女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響

3.2 女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥因子的影響 由表2可知，與對照組比較，模型組軟骨細胞中IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，女貞子多糖各劑量組軟骨細胞中IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高，呈劑量依賴性(P<0.05)。

表2 女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥因子的影響

3.3 女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞中circ_0039411、miR-145表達的影響 由圖2可知，與對照組比較，模型組軟骨細胞中circ_0039411表達升高，miR-145表達降低(P<0.05)；與模型組比較，女貞子多糖各劑量組軟骨細胞中circ_0039411表達降低，miR-145表達升高，并呈劑量依賴性(P<0.05)。

注：1～5分別為對照組，模型組，女貞子多糖低、中、高劑量組。與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與女貞子多糖低劑量組比較，&P<0.05；與女貞子多糖中劑量組比較，$P<0.05。圖2 各組細胞中circ_0039411、miR-145的表達Fig.2 Expressions of cellular circ_0039411 and miR-145 in each

3.4 干擾circ_0039411對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷及炎癥因子的影響 由圖3、表3可知，與模型組比較，si-NC組軟骨細胞circ_0039411、miR-145表達，細胞活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表達，IL-8、IL-6、IL-10水平均無明顯變化(P>0.05)；與si-NC組比較，si-circ_0039411組軟骨細胞circ_0039411表達降低，miR-145表達升高，細胞活性升高，凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。

注：1～3分別為模型組、si-NC組、si-circ_0039411組。A為各組細胞凋亡情況，B為各組細胞凋亡相關蛋白表達，C～D為circ_0039411、miR-145表達。與模型組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05。圖3 干擾circ_0039411對軟骨細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of interference with circ_0039411 on chondrocyte apoptosis

3.5 miR-145對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷及炎癥因子的影響 由圖4、表4可知，與模型組比較，miR-NC組軟骨細胞miR-145表達，細胞活性，凋亡率，Bax、Bcl-2蛋白表達，IL-8、IL-6、IL-10水平均無明顯變化(P>0.05)；與miR-NC組比較，miR-145組軟骨細胞miR-145表達升高，細胞活性升高，細胞凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高(P<0.05)。

表3 干擾circ_0039411對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷及炎癥因子的影響

注：1～3分別為模型組、miR-NC組、miR-145組。A為各組細胞凋亡情況，B為各組細胞凋亡相關蛋白表達，C為各組細胞miR-145表達。與模型組比較，*P<0.05;與miR-NC組比較，#P<0.05。圖4 miR-145對軟骨細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of miR-145 on chondrocyte apoptosis

3.6 circ_0039411和miR-145靶向關系 由圖5可知，circ_0039411和miR-145互補序列。由表5可知，WT-circ_0039411與miR-145共轉染后的細胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，而MUT-circ_0039411與miR-145共轉染后的細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

3.7 過表達circ_0039411或抑制miR-145可逆轉女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷炎癥因子的影響 由圖6、表6可知，與女貞子多糖組比較，女貞子多糖+pcDNA-circ_0039411組和女貞子多糖+anti-miR-145組軟骨細胞的活性降低，細胞凋亡率升高，Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。

表4 miR-145對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷及炎癥因子的影響

圖5 circ_0039411和miR-145互補序列Fig.5 Complementary sequence of circ_0039411and miR-145

表5 雙熒光素酶報告基因

4 討論

骨關節炎是退行性關節疾病，以關節軟骨破壞為特征，其中軟骨細胞凋亡起著關鍵作用；而炎癥可引起軟骨細胞凋亡，導致軟骨破壞[13-14]。研究發現中藥可緩解關節炎患者病癥，治療骨關節炎[15]。研究報道鷹嘴豆素通過抑制含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLR family, pyrin domain-containing 3，NLRP3)介導的細胞凋亡可減輕骨關節炎[16]；青蒿琥酯可減輕IL-1β誘導的炎癥反應和細胞凋亡，并延緩小鼠模型中骨關節炎的進展[17]；女貞葉的甲醇提取物在嚙齒類動物中具有止痛和消炎作用[18]；女貞細枝中分離出的新的類蛇藥苷具有抗炎和神經保護作用[19]，而女貞子多糖對關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應的影響尚不清楚。本實驗用IL-1β誘導軟骨細胞模擬體外骨關節炎，用不同劑量女貞子多糖進行處理，結果顯示，軟骨細胞活性升高，細胞凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，IL-8、IL-6水平升高，IL-10水平降低，呈劑量依賴性。IL-8、IL-6是促炎因子，IL-10是抑炎因子，表明女貞子多糖可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡和炎癥反應。

注：1～4分別為模型組、女貞子多糖組、女貞子多糖+pcDNA-circ_0039411組、女貞子多糖+anti-miR-145組。A為各組細胞凋亡情況，B為各組細胞凋亡相關蛋白表達，C～D為各組細胞circ_0039411、miR-145表達。與模型組比較，*P<0.05；與女貞子多糖組比較，#P<0.05。圖6 過表達circ_0039411或抑制miR-145對軟骨細胞凋亡的影響Fig.6 Effects of circ_0039411 overexpression or miR-145 inhibition on chondrocyte apoptosis

表6 過表達circ_0039411或抑制miR-145對軟骨細胞損傷炎癥因子的影響

研究報道miR-145通過直接抑制絲裂原活化的蛋白激酶激酶4(mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4)來減輕骨關節炎中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)驅動的軟骨基質降解[20]。來自脂肪干細胞的外泌體通過上調miR-145促進軟骨生成并抑制炎癥[21]。LncRNA MALAT1通過調控miR-145調節人骨關節炎中IL-1β誘導的軟骨細胞活力和軟骨基質降解[22]。本實驗結果顯示，過表達miR-145后軟骨細胞的活性升高，細胞凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，IL-8、IL-6水平降低，IL-10水平升高，表明過表達miR-145可抑制IL-1β誘導的軟細胞凋亡和炎癥反應。此外，本實驗證明circ_0039411靶向調控miR-145，干擾circ_0039411表達的作用與過表達miR-145的作用相同。本實驗還發現女貞子多糖可提高circ_0039411的表達，降低miR-145的表達，而過表達circ_0039411或抑制miR-145可逆轉女貞子多糖對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷的影響。

綜上所述，女貞子多糖可能通過調節circ_0039411/miR-145緩解IL-1β誘導的關節軟骨細胞損傷和炎癥反應。