黃芪甲苷對川崎病冠脈損傷小鼠的保護作用

張菲菲， 成 芳， 馬紅芬， 康利娜， 賈碧紅， 安 紅

(邢臺市人民醫院，河北 邢臺 054000)

川崎病是兒童時期常見的一種急性自限性血管炎，一般指黏膜皮膚淋巴結綜合癥，常見臨床表現有發熱、皮疹、眼結合膜充血、頸部非膿性淋巴結腫大等。調查顯示，我國川崎病的發病率約為51/100 000，主要發生于5歲以內嬰幼兒[1]，大多呈自限性，但仍有20%～25%可并發嚴重的心血管病，甚至引發心力衰竭[2]。因此，降低川崎病患兒冠脈并發癥風險，保護其冠脈組織意義重大。

丙種球蛋白(IVIG)是川崎病常用的治療藥物，效果確切，并對冠脈損傷有一定的保護作用，但在并發冠脈損傷的川崎病患兒中IVIG的效果不理想[3]。黃芪甲苷可保護大鼠冠脈組織，減輕炎癥浸潤[4]，但各成分是否可減輕川崎病患者的冠脈損傷尚不明確。白介素-35(IL-35)可調控Janus激酶1(JAK1)/信號轉導和轉錄激活子1(STAT1)通路參與川崎病所致的冠脈損傷，它屬于免疫負調控分子，可增加JAK1、STAT1及其磷酸化表達，參與炎癥反應，誘發冠脈組織炎癥浸潤[5-7]。因此，本研究建立C57BL/6小鼠川崎病冠脈損傷模型，探討黃芪甲苷是否通過調控該信號通路來減輕川崎病所致的冠脈損傷。

1 材料

1.1 動物 清潔級C57BL/6小鼠58只，雌雄各半，4～6周齡，體質量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2020-0002。

1.2 試劑與藥物 干酪乳桿菌細胞壁提取物(湖南朗林生物資源股份有限公司，批號R1912105)；黃芪甲苷對照品(純度≥99.6%，成都科程生物科技開發有限公司，批號201910145)；IVIG(成都蓉生藥業有限責任公司，批號201908A103)。鼠IL-35、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒(上海信帆生物科技公司，批號RS1811102、RS1905137、R1904126)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(山東博科生物產業有限公司，批號201907A)；原位末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒(瑞士Roche公司，批號AR1904135007)；Trizol溶液(美國Invitrogen公司，批號1907125003)；逆轉錄試劑盒(德國Qiagen公司，批號R1812102C)；細胞裂解液(上海麥克林生化科技有限公司，批號CL18350)；蛋白質提取試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號P190115)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠(上海聯邁生物工程有限公司，批號1910117)；兔單克隆抗體IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1，酶標記的羊多克隆抗體IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1[艾博抗(上海)貿易有限公司，批號R19101、R19072、R19038、R19041、R19117、R19091、R19108、R19026]。

1.3 儀器 FA-1 A型勻漿機(江蘇盛藍儀器制造有限公司)；TG22-WS型醫用離心機(長沙湘銳離心機有限公司)；JB-5C型光學顯微鏡(上海光學儀器廠)；SP-723型分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；9700型聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國ABI公司)；SE 600X Chroma型電泳儀(美國Hofer公司)；170-3940型轉膜儀(美國Bio-Rad公司)；FluorChem R型號凝膠成像分析系統(美國ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 建模、分組及給藥 參照川崎病冠脈損傷建模操作規程[8]，50只C57BL/6小鼠單次腹腔注射0.5 mg干酪乳桿菌細胞壁提取物，第5天按照文獻[8]標準判斷是否建模成功。將建模成功的小鼠隨機分為模型組、IVIG組及黃芪甲苷低、中、高劑量，另取8只小鼠作為對照組，IVIG組腹腔注射2 mg/g IVIG(臨床等效劑量)，黃芪甲苷低、中、高劑量組分別腹腔注射0.25、0.5、1.0 mg/kg黃芪甲苷(分別為臨床等效劑量的1/2、臨床等效劑量、臨床等效劑量的2倍)，對照組、模型組均腹腔注射等容量生理鹽水，于建模成功并分組后當天開始給藥，每天1次，連續1周。

2.2 ELISA法檢測血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平 小鼠斷頭取血，3 000 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清，即得血清；迅速剝離心臟，洗凈后取心臟組織進行勻漿，12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取上清液，即得心臟組織勻漿液，按照試劑盒說明書檢測小鼠血清和心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平。

2.3 HE染色觀察冠脈病變情況 取小鼠冠脈組織，經固定、沖洗、脫水、包埋、切片、攤片、烤片、脫蠟后采用蘇木素染色10 min，鹽酸乙醇分化3～5 s，飽和碳酸鋰返藍，伊紅復染，最后中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。

2.4 TUNEL法檢測冠脈組織細胞凋亡率 按“2.3”項下方法制作組織切片，于脫蠟后加入蛋白酶K工作液，在37 ℃下反應30 min，室溫固定30 min，按照TUNEL試劑盒說明書操作，棕黃色染色的細胞為冠脈組織凋亡細胞，隨機選取5個不重復視野計算凋亡細胞占比，即為冠脈組織細胞凋亡率。

2.5 RT-qPCR法檢測冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達 小鼠冠脈組織液氮研磨后按Trizol法提取總RNA，分光光度計檢測其濃度，鑒定純度，以1.8～2.0為合格，逆轉錄為cDNA。PCR反應體系為95 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，74 ℃ 90 s，70 ℃ 20 s，共35個循環，最后52 ℃ 10 min。以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，參照NCBI基因數據庫設計引物序列，IL-35正向5′-TCGTATAGGCTTATAGCTATG-3′，反向5′-AGGCTAGAGGGAGAGCTTAG-3′，預計擴增產物長度240 bp；JAK1正向5′-CTGAGATTGAGAGGAGGTTA-3′，反向5′-GAGATC TCGAGAGGAGGCTATAGCTAG-3′，預計擴增產物長度320 bp；STAT1正向5′-CGCGATATATGCG GCGCGATATGC-3′，反向5′-GAGAGCTTAGGAGAG CTAG-3′，預計擴增產物長度256 bp；β-actin正向5′-AGGACTCTTAGAGCTAG-3′，反向5′-TAGAGC TTTCTAGAGCTAG-3′，預計擴增產物長度180 bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.6 Western blot法檢測冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達 小鼠冠脈組織液氮研磨后用磷酸鹽緩沖液沖洗，2 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，沉淀物中加入裂解液提取蛋白，SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，加入兔抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1單克隆抗體(1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000)，在4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，加入酶標記的羊抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1多克隆抗體(稀釋倍數1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶5 000)，室溫靜置2 h，洗膜，加入化學發光液曝光顯影，采用凝膠成像分析系統計算蛋白相對表達。

3 結果

3.1 造模情況 50只小鼠中48只建模成功，成功率為96.00%，分別為模型組9只、IVIG組10只、黃芪甲苷低劑量組10只、黃芪甲苷中劑量組10只、黃芪甲苷高劑量組9只，給藥期間各組小鼠均無脫落。

3.2 黃芪甲苷對小鼠血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平的影響 如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織IL-35水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組血清及心臟組織IL-35水平均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芪甲苷高劑量組小鼠血清及心臟組織IL-35水平高于IVIG組(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芪甲苷高劑量組小鼠血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平低于IVIG組(P<0.05)。

3.3 黃芪甲苷對小鼠冠脈病理變化的影響 如圖1所示，對照組小鼠冠脈組織細胞排列致密、規整，血管內壁光滑，未見炎癥細胞浸潤；模型組小鼠冠脈組織細胞排列嚴重紊亂，血管內壁極度不光滑，可見較多炎癥細胞浸潤；黃芪甲苷低劑量組小鼠冠脈組織細胞排列明顯紊亂，血管內壁明顯不光滑，可見部分炎癥細胞浸潤；黃芪甲苷中劑量組和IVIG組冠脈組織細胞排列紊亂，血管內壁不光滑，可見少量炎癥細胞浸潤；黃芪甲苷高劑量組冠脈組織細胞排列稍有紊亂，血管內壁欠光滑，可見較少炎癥細胞浸潤。

3.4 黃芪甲苷對小鼠冠脈組織細胞凋亡率的影響 如表2、圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織細胞凋亡率均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織細胞凋亡率低于IVIG組(P<0.05)。

表1 各組小鼠血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平

圖1 各組小鼠冠脈病變(HE染色，×400，50 μm)Fig.1 Mouse coronary artery lesions in each group (HE staining, ×400, 50 μm)

表2 各組小鼠冠脈組織細胞凋亡率

圖2 各組小鼠冠脈組織TUNEL染色(×400，50 μm)Fig.2 TUNEL staining of mouse coronary tissues in each group(×400, 50 μm)

3.5 黃芪甲苷對小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達的影響 如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達高于IVIG組(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達均低于IVIG組(P<0.05)。

3.6 黃芪甲苷對小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達的影響 如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達高于IVIG組(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達高于IVIG組(P<0.05)。

表3 各組小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達

表4 各組小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達

4 討論

川崎病冠脈損傷的發生和發展機制復雜，急性炎癥、免疫失衡、氧化應激損傷等均可能參與川崎病并發心血管病的進程[9-10]。在川崎病患兒急性期和亞急性期，外周血T淋巴細胞處于異常免疫激活狀態，以T細胞亞群失衡為主要表現，而T細胞異常激活可導致炎癥細胞因子合成和分泌紊亂，其中IL-35水平下降，TNF-α與IL-6水平則升高[11-13]。黃芪具有補氣固表、養血補氣、補中益氣等功效，具有抗氧化、減輕炎癥反應和保護心肌組織的作用，黃芪甲苷是黃芪的主要成分，且在既往報道中發現黃芪甲苷還可增強機體免疫力，調節T淋巴細胞亞群的水平和生物學活性[14-15]。因此，本研究探討了黃芪甲苷防治川崎病冠脈損傷的作用。

IVIG屬于一種重要的免疫調節劑，可增強免疫力，調節免疫平衡，IVIG靜脈注射治療川崎病患兒療效確切[16]，且對冠脈損傷也有一定的防治作用，故本研究選用IVIG作為陽性對照藥物。此外，本研究采用干酪乳桿菌細胞壁提取物腹腔注射建立川崎病冠脈損傷小鼠模型，成功率達96.00%[17]，證實采用該方法可支撐完成本次實驗。本研究結果發現，與對照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織IL-35水平降低，TNF-α、IL-6水平及冠脈組織細胞凋亡率均升高，冠脈組織呈嚴重病理改變；而給予IVIG和黃芪甲苷干預后，以上指標均有改善。提示，黃芪甲苷和IVIG均可減輕小鼠川崎病炎癥反應和冠脈組織損傷，減少冠脈組織細胞凋亡，且高劑量黃芪甲苷的效果優于低、中劑量黃芪甲苷和IVIG。

川崎病所致的冠脈損傷與炎癥反應有著密切關系。IL-35屬于白介素-12家族的重要成員，可由調節性T細胞、CD4+T細胞、內皮細胞及平滑肌細胞等產生和分泌，可抑制炎癥反應，調節免疫平衡，在多種炎癥與自身免疫性疾病中其水平均下降。血清IL-35水平下降很可能是癥狀性冠脈疾病的預測因子，也是冠脈心肌功能的關鍵因素[18]。在川崎病早期，調節性T細胞與CD4+T細胞活性下降，IL-35減少，是引發炎癥反應、導致冠脈損傷的重要病因[19]。一方面，IL-35水平下降可激活JAK1/STAT1通路，增加STAT1磷酸化表達，JAK1和STAT1均有促凋亡、促炎癥作用，在冠脈炎癥損傷、冠脈細胞缺血缺氧性變性及凋亡等病理改變中均積極參與且均有較強的活性[20-21]。另一方面，IL-35可負向調控效應T細胞，其水平下降可使得分泌TNF-α、IL-6等因子的免疫細胞活性增加，共同參與川崎病所致的冠脈炎及組織炎癥浸潤[22]。本研究中顯示，模型組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA和蛋白表達均低于對照組，p-STAT1蛋白表達及JAK1、STAT1 mRNA和蛋白表達均高于對照組；黃芪甲苷各劑量和IVIG干預后，以上指標均有改善。提示，黃芪甲苷能夠是通過上調IL-35表達，抑制JAK1/STAT1信號通路轉導，下調JAK1、STAT1、p-STAT1表達，發揮對小鼠川崎病冠脈損傷的保護作用。黃芪甲苷的作用呈劑量依賴性，且高劑量黃芪甲苷效果更優，提示黃芪甲苷在川崎病冠脈病變防治方面有良好的價值。

綜上所述，黃芪甲苷和IVIG均可增加血清及心臟組織IL-35水平，降低TNF-α、IL-6水平，減輕炎癥反應和冠脈組織病理改變，減少冠脈組織細胞凋亡，呈劑量依賴性，且高劑量黃芪甲苷的效果更優。黃芪甲苷可能是通過上調IL-35表達，抑制JAK1/STAT1信號通路，下調JAK1、STAT1、p-STAT1表達，實現對小鼠川崎病冠脈損傷的保護作用。