番荔枝果皮弱極性成分研究(Ⅳ)

陳亞運， 謝華永， 王麗媛

(1.泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023)

番荔枝又名林檎、釋迦果，為番荔枝科植物番荔枝AnnonasquamosaLinn.的果實，原產于美洲中部，我國引種后已在云南、廣西、廣東等地形成一定種植規模，其果實可治惡瘡腫痛[1]，種子因含有內酯類成分而對多種腫瘤細胞具有殺傷作用[2-4]。研究者從番荔枝果皮醇提物中發現了具有抗腫瘤活性的對映-貝殼杉烷型二萜[5]；課題組前期研究證明了番荔枝果皮的抗腫瘤活性，并從中分離出多種該類二萜[6-10]。本實驗對番荔枝果皮弱極性成分進行分離，從中得到7個化合物，其中1為新化合物，2、3、5、7為首次從番荔枝果皮中分離得到。

1 材料

Avance-400型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Xevo G2-XS Q-TOF高分辨液質聯用儀、2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Affinity-1S型傅立葉變換紅外光譜儀(日本Shimadzu公司)；UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；SMP10型熔點測定儀(英國Stuart公司)；RE-52A型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；ZF-1型紫外分析儀(上海舒源分析儀器廠)。柱色譜硅膠(100、200～300目)、TLC硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)。番荔枝果實于2016年10月購自云南省臨滄市秀川生物科技公司，經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定為番荔枝科植物番荔枝AnnonasquamosaLinn.的成熟果實，人工剝離后風干備用(留樣編號20161025zh)。甲醇為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司)；95%乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇為分析純(廣東光華科技股份有限公司)；氘代試劑(DMSO-d6、CDCl3，美國劍橋公司)。

2 提取與分離

將8 kg果皮粉碎成粗粉，10倍量95%乙醇滲漉提取，合并提取液，減壓濃縮后得到浸膏400 g，乙酸乙酯溶解，100目硅膠拌樣，200～300目硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(1∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、0∶1)、乙酸乙酯-甲醇(100∶1、50∶1、10∶1、0∶1)洗脫，每1 L為1個流分，TLC追蹤并合并相同流分，共得到15個部位段Fr.1～Fr.15。Fr.3裝入細長型AgNO3硅膠柱，石油醚-丙酮(20∶1)洗脫，2次分離后得化合物3(16.5 mg)。Fr.5部位經干法拌樣后裝入硅膠柱，石油醚-丙酮(50∶1～1∶1)洗脫，分為5段Fr.5.1～Fr.5.5，Fr.5.1、Fr.5.2合并后石油醚-丙酮(100∶1～20∶1)洗脫，得化合物1(31.5 mg)；Fr.5.5以硅膠柱分離，石油醚-丙酮(10∶1)洗脫，得化合物6(23.2 mg)。Fr.6分為3段Fr.6.1～Fr.6.3經硅膠柱分離，石油醚-丙酮(5∶1～1∶2)洗脫，得化合物4(34.1 mg)、5(22.8 mg)。Fr.7、Fr.8質量相對較低，而且均有白色沉淀，故合并后抽濾，濾液Fr.8.2經硅膠柱分離，二氯甲烷-甲醇(10∶1～2∶1)洗脫，得化合物2(8.4 mg)、7(11.7 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于甲醇，mp 223～224 ℃。UV光譜未見明顯吸收峰，IR光譜中2 950 cm-1吸收峰，此為CH2片段；又可見3 200～3 500、1 000 cm-1左右的吸收峰，表明結構中有多個OH存在。HRESI-MSm/z:293.248 0[M+H]+，分子式為C19H32O2，不飽和度為4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)顯示有2個甲基δH0.92 (s, 3H, H-20), 0.96 (s, 3H, H-19)。結合13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 和HSQC可確認有19個碳信號，包括2個甲基、10個亞甲基、4個次甲基、3個季碳。結合文獻[11]，可知該化合物為對映-貝殼杉烷型二萜且與annosquamosin C相似。在HMBC譜中，根據OH (δH3.89)對C-3 (δC43.0)、C-4 (δC70.4)、C-5 (δC57.2)、C-19 (δC22.9)的相關，可推斷出OH位于C-4上；OH (δH4.28)與C-17 (δC62.4)的相關可推斷出CH2OH的存在；H-13 (δH2.08)、H-15 (δH1.00)對C-17 (δC62.4)的相關可推斷出CH2OH為17位，具體見表1。NOESY譜中OH (δH3.89)/H-3 (δH1.46, 1.59)的相關信號表明，C-4位的OH在平面上方，為β型，而CH3在19位，為α型；H-17 (δH3.45)/H-13 (δH2.08)、H-17 (δH3.45)/H-14 (δH2.04)的相關信號表明C-17在平面下，為α型，見圖1。綜上所述，化合物1命名為16β-17-hydroxy-18-nor-ent-kaurane-4β-ol，經SciFinder數據庫檢索未見相關報道，表明該化合物為新的對映-貝殼杉烷型二萜。

表1 化合物1的1H-NMR、13C-NMR波譜數據

圖1 化合物1 HMBC和NOESY相關Fig.1 HMBC and NOESY correlations of compound 1

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H30O4，HRESI-MSm/z:333.205 9[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ:12.00 (1H, s, H-17)，12.00 (1H, s, H-18)，1.09 (3H, s, H-18)，0.86 (3H, s, H-20)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ:40.3 (C-1)，18.2 (C-2)，37.7 (C-3)，42.1 (C-4)，56.0 (C-5)，22.3 (C-6)，40.9 (C-7)，45.0 (C-8)，54.5 (C-9)，39.0 (C-10)，18.8 (C-11)，30.7 (C-12)，40.4 (C-13)，37.6 (C-14)，44.2 (C-15)，44.5 (C-16)，178.1 (C-17)，28.6 (C-18)，178.6 (C-19)，15.3 (C-20)。對比文獻[12]，鑒定為16β-ent-kaurane-17,19-dioic acid。

化合物3：無色針晶，易溶于二氯甲烷，分子式C21H32O2，HRESI-MSm/z: 315.195 5[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 2.06 (3H, s, COCH3)，1.27 (3H, s, H-19)，0.96 (1H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 41.5 (C-1)，18.2 (C-2)，36.4 (C-3)，37.1 (C-4)，56.8 (C-5)，20.4 (C-6)，40.4 (C-7)，44.2 (C-8)，56.2 (C-9)，39.2 (C-10)，18.2 (C-11)，33.2 (C-12)，44.0 (C-13)，39.6 (C-14)，49.1 (C-15)，155.8 (C-16)，103.0 (C-17)，27.6 (C-18)，67.2 (C-19)，18.1 (C-20)，171.4 (OCOCH3)，21.0 (OCOCH3)。對比文獻[13]，鑒定為ent-kaurane-16-en-18-ol, acetate。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H32O3，HRESI-MSm/z: 319.228 3[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.99 (1H, s, H-19)，4.04 (1H, s, 16-OH)，1.22 (3H, s, H-17)，1.09 (3H, s, H-18)，0.88 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 40.7 (C-1)，19.2 (C-2)，38.1 (C-3)，43.3 (C-4)，55.9 (C-5)，22.4 (C-6)，42.2 (C-7)，45.1 (C-8)，56.5 (C-9)，39.6 (C-10)，18.4 (C-11)，27.0 (C-12)，48.2 (C-13)，37.5 (C-14)，58.0 (C-15)，77.4 (C-16)，24.9 (C-17)，29.0 (C-18)，179.1 (C-19)，15.8 (C-20)。對比文獻[14]，鑒定為16α-hydroxy-ent-kaurane-19-oic acid。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H30O4，HRESI-MSm/z: 333.207 7[M-H]-。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.83 (1H, s, H-17)，11.83 (1H, s, H-19)，1.11 (3H, s, H-18)，0.87 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 40.5 (C-1)，19.3 (C-2)，38.1 (C-3)，43.3 (C-4)，56.4 (C-5)，22.4 (C-6)，41.7 (C-7)，44.3 (C-8)，56.2 (C-9)，39.5 (C-10)，18.2 (C-11)，27.6 (C-12)，39.2 (C-13)，40.3 (C-14)，42.0 (C-15)，45.3 (C-16)，175.9 (C-17)，29.0 (C-18)，179.1 (C-19)，15.8 (C-20)。對比文獻[15]，鑒定為16α-ent-kaurane-17,19-dioic acid。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C19H32O3，HRESI-MSm/z: 307.204 7[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 4.53 (1H, s, 16-OH)，3.92 (1H, s, 4-OH)，3.58 (1H, s, 17-OH)，1.10 (3H, s, H-18)，1.01 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 40.4 (C-1)，18.2 (C-2)，41.4 (C-3)，70.5 (C-4)，56.4 (C-5)，18.7 (C-6)，41.8 (C-7)，43.5 (C-8)，54.9 (C-9)，39.3 (C-10)，19.7 (C-11)，27.2 (C-12)，41.0 (C-13)，38.5 (C-14)，53.1 (C-15)，79.0 (C-16)，70.0 (C-17)，31.2 (C-18)，17.7 (C-20)。對比文獻[16]，鑒定為ent-kaurane-19-nor-4α,16α,17-triol。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇，分子式C20H28O4，HRESI-MSm/z: 331.190 5[M-H]-。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.00 (1H, s, H-17)，12.00 (1H, s, H-18)，0.92 (3H, s, H-19)，0.86 (3H, s, H-20)。13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 39.7 (C-1)，18.2 (C-2)，37.7 (C-3)，42.8 (C-4)，55.5 (C-5)，20.1 (C-6)，42.8 (C-7)，49.8 (C-8)，45.2 (C-9)，37.6 (C-10)，18.8 (C-11)，25.0 (C-12)，39.9 (C-13)，39.0 (C-14)，151.6 (C-15)，138.4 (C-16)，178.5 (C-17)，182.4 (C-18)，28.5 (C-19)，15.2 (C-20)。對比文獻[17]，鑒定為ent-kaurane-15-en-17,18-dioic acid。

4 結論

本研究從番荔枝果皮中分離鑒定了7個對映-貝殼杉烷型二萜，其中新化合物1個。今后，將對上述化合物進行抗腫瘤活性研究，以期為挖掘番荔枝果皮相關機制提供參考。