菘藍種質資源評價

楊福紅， 趙 鑫， 王 盼， 劉 東， 陳紅剛， 王惠珍， 杜 弢*

(1.甘肅中醫藥大學和政藥用植物園，甘肅 和政 731200；2.平涼市農業科學院，甘肅 平涼 744000；3.西北中藏藥協同創新中心，甘肅 蘭州 730000)

菘藍IsatisindigoticaFort.是十字花科菘藍屬兩年生草本植物，野生種質資源難以找到，故對各地栽培種群的保護利用尤為重要[1]。目前，有關菘藍種質資源、板藍根質量評價方面的研究較多，前者主要采用農學、分子生物學、中藥化學等方法[2-5]，而后者包括傳統鑒別法、顯微鑒別法、藥用成分含量比較法、指紋圖譜法、重金屬、農藥殘留等多種手段[4-8]，但均存在一定的片面性，難以全面客觀地進行綜合評價。

近年來，灰色關聯度分析、DTOPSIS法廣泛應用于作物品種、種質資源評價[9-18]，前者能從事物發展趨勢的整體進行分析，將影響結果的各評價指標合一后進行評價，可更客觀確定其權重，也更接近真實情況[9-12]；后者依據評價對象最優解與最劣解的距離進行排序，即最接近最優解的最優，最接近最劣解的最差，但缺點是各性狀指標權重受主觀因素影響太大，兩者聯用可同時綜合農學、藥學多種指標，更全面有效地評價種質資源[13-17]。本實驗測定菘藍農學性狀和板藍根中主要成分含量，并聯合應用灰色關聯度分析與DTOPSIS法對該種質資源進行綜合評價，以期為構建中藥材種質資源綜合評價模型提供參考依據。

1 材料

27份菘藍種質資源由平涼市農科院提供，經專家鑒定為正品，具體見表1。

表1 種質資源信息

2 方法

2.1 農藝指標測定 采用隨機區組設計，無重復，每份資源種植1個小區，小區面積為3.5 m2(長3.5 m，寬1 m)，于2019年4月24日播種，播種量為10 g，行距30 cm，10月下旬對27份種質資源進行農藝性狀的調查和產量測定，每份選取10株，指標包括株高、株幅、葉片大小、葉片數、單株葉重、根長、根粗、單株根重、側根數、側根重，收獲后測量葉、根產量。

2.2 含量測定 參照柴俊雯[7]、張劍光[8]等報道加以完善，采用HPLC法測定板藍根中尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷含量。

2.2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～10 min, 10%B; 10～15 min, 17%B; 15～20 min, 20%B; 20～25 min, 20%B; 25～30 min, 25%B; 30～35 min, 30%B; 35～37 min, 35%B; 37～45 min, 30%B; 45～50 min, 10%B; 50～60 min, 10%B)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.尿苷 2.鳥苷 3.(R,S)-告伊春 4.腺苷1.uridine 2.guanosine 3.(R,S)-goitrin 4.adenosine圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷對照品適量，加水定容至10 mL棕色量瓶中，超聲處理5 min，制成質量濃度分別為0.072 4、0.069 0、0.206 0、0.035 95 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 將板藍根粉碎后過3號篩，精密稱取1 g，加50 mL水至150 mL具塞錐形瓶中，稱定質量，超聲處理50 min，加水補足減失的質量，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 方法學考察 線性關系考察結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。取同一對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面積RSD分別為0.42%、0.44%、0.39%、0.47%，表明儀器精密度良好。取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24、36 h在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定7次，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面積RSD分別為1.04%、1.33%、2.89%、1.13%，表明溶液在36 h內穩定性良好。取同一批樣品1 g，共5份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷峰面積RSD分別為1.29%、0.77%、2.52%、0.81%，表明該方法重復性良好。精密稱取各成分含量已知的同一批樣品9份，分別按80%、100%、120%水平精密加入對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春、腺苷平均加樣回收率分別為97.00%、98.32%、97.59%、96.84%，RSD分別為2.06%、3.50%、1.85%、2.20%。

表2 各成分線性關系

3 結果

結果，各性狀指標的權重依次為鳥苷含量>尿苷含量>根長>側根高>葉長>株幅>葉片數>根粗>株高>(R,S)-告依春含量>葉產量>腺苷含量>側根數>根產量>單株根重>葉寬>單株葉重>側根重，見表4。

表3 各種質資源性狀指標

表4 性狀指標灰色關聯度及關聯序

表5 DTOPSIS法結果

由此可知，Ci值前五位的為河北2018-1、2008-11、2008-6-2、隆德菘藍、張掖菘藍；加權關聯度值排名前五位的為2008-6-2、河北2018-1、2008-11、2015-2-3、楊凌菘藍；板藍根產量排名前五位的為2008-11、楊凌菘藍、河北菘藍、2008-6-2、張掖菘藍；(R,S)-告依春含量排名前五位的為2008-6-6-1-1、 2008-11、楊凌誘變1、2008-10、2015-2-3，表明依據加權關聯度、Ci值的排列順序在整體上變化不大，而依據板藍根產量或(R,S)-告依春含量時變化較大，故灰色關聯度分析結合DTOPSIS法的評價效果比僅依靠產量或藥用成分更全面可靠。另外，河北2018-1、2008-11、2008-6-2 3種種質資源的綜合表現較好，可作為育種材料或優良品系。

3.3 聚類分析 采用DPS軟件對27份種質資源的Ci值、加權關聯度進行聚類分析，結果見圖2～3，發現均可分為4類，并且除河北菘藍外聚類情況一致，但排列順序有變化，綜合表現依次為A類>B類>C類>D類。

圖2 Ci值聚類分析Fig.2 Cluster analysis for Ci values

4 討論

單獨應用灰色關聯度分析或DTOPSIS法在農作物的種質資源評價和品種比較中應用較多[15-24]，單獨利用DTOPSIS法在評價種質資源或品種時，在確定各性狀的權重時常依靠經驗進行人為的賦值權重，造成評價結果受主觀因素影響較大[12-15]。灰色關聯度分析能夠從整體出發，通過對數據的標準化處理和構建理想品種，從而確定各性狀的權重，克服了人為因素的影響。近年來，結合兩種方法在農作物種質資源評價和品種比較中應用提高了分析結果的可靠性和全面性[18-24]。本試驗利用灰色關聯度和DTOPSIS法對27份菘藍種質資源進行綜合評價，克服了單一依靠產量，或某一種或幾種藥用成分含量作為評價指標單一性、片面性和主觀性，其評價結果更加客觀公正。為菘藍種質資源的綜合評價提供了一種新的思路和方法。通過對27份菘藍種質資源的綜合評價，篩選出優質育種材料河北2018-1、2008-11和2008-6-2，可作為育種材料或優良品系生產上使用，同時為中藥材種質資源綜合評價提供新的思路和方法。因試驗對種質資源的指標測定不夠全面，特別是對抗病性、生育期、抗凍性等指標未測定，對試驗結果有一定程度的影響，在以后的試驗中進一步完善，為育種提供更加可靠的評價依據。