3種形態全緣兔耳草不同藥用部位中6種成分測定

高必興， 何 芳， 齊景梁， 茍 琰， 耿 昭， 鐘 戀， 蔣桂華， 蔣運斌

(1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 610072；2.四川省藥品檢驗研究院/國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，四川 成都 611731；3.西南大學藥學院中醫藥學院，重慶 400715)

全緣兔耳草LagotisintegraW. W. Smith收載于《衛生部頒藥品標準藏藥第一冊》及《云南省藥品標準》，分布于我國四川西南部、西藏東部及青海西南部，具有清熱解毒、行血調經、活血續筋。用于瘡瘍、中毒、炭疽、月經不調等[1-2]，苯乙醇苷類、環烯醚萜苷類為該藥材治療熱性肝病的主要活性成分[3-12]，但現有標準及文獻均未收載其所含成分的含量測定[13]，僅測定其同屬植物短筒兔耳草中松果菊苷(苯乙醇苷類成分)含量[14]。前期報道，全緣兔耳草含有大車前苷及鞭打繡球苷B這2種苯乙醇苷類成分，以及10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇[15]、梓醇、桃葉珊瑚苷[15-17]這4種環烯醚萜苷類成分。

全緣兔耳草有3種不同植物形態，第1類產于石渠、德格等地，花白色，花莖直立，基生葉葉柄稍長；第2類主產于西藏，花序紫色，基生葉葉柄短，花莖多匍匐；第3類主產于四川理塘、稻城、雅江等地，花黃白色，基生葉葉柄長，葉近披針形，花莖直立。《衛生部頒藥品標準藏藥第一冊》收載全緣兔耳草的藥用部位為全草[1]，但在青海、西藏主要使用其地上部分。由于全緣兔耳草主要為野生資源，生長海拔高，環境惡劣，導致其分布范圍及產量逐年減小，而藏區人民采藥時習慣將其連根挖出，更導致資源大規模破壞，無法再生。因此，本實驗測定全緣兔耳草3種形態、藥用部位(全草、地上部位、地下部位)中大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷的含量，以期為其資源可持續發展研究提供依據。

1 材料

LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)； BP211D電子天平(十萬分之一，德國Sartorious公司)；Milli-Q超純水機(美國密理博公司)。鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇對照品均為實驗室分離純化；大車前苷(批號111914-201604)、桃葉珊瑚苷(批號111761-200601)、梓醇(批號111808-202112)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。8批全緣兔耳草經四川省藥品檢驗研究院黎躍成主任中藥師研究鑒定為正品，并通過花的顏色和葉的形態將其分成3類，見表1。甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水。

2 方法

2.1 鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇含量測定

2.1.1 色譜條件 沃特世X-bridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.4%甲酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，14% A；20～35 min，14%～17%A；35～62 min，17%～20%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長325 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

1.大車前苷 2.鞭打繡球苷B 3.10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇 4.10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇1.plantagoside 2.hemiphroside B 3.10-O-trans-p-methoxycinnamoyl-catalpol 4.10-O-[(E)-3,4-dimethoxycinnamoyl]catalpol圖1 各成分HPLC色譜圖(Ⅰ)Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents(Ⅰ)

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇及10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇對照品適量，加甲醇制成各成分質量濃度約為1 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取樣品粉末約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，稱定質量，回流提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，即得。

2.2 梓醇、桃葉珊瑚苷含量測定

2.2.1 色譜條件 沃特世Atlantis T3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.2%磷酸(2∶98)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖2。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取梓醇、桃葉珊瑚苷對照品適量，流動相制成各成分質量濃度約為0.8 mg/mL的溶液，即得。

1.梓醇 2.桃葉珊瑚苷1.catalpol 2.aucubin圖2 各成分HPLC色譜圖(Ⅱ)Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents (Ⅱ)

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取“2.1.3”項下供試品溶液20 mL，濃縮至近干，流動相溶液溶解并轉移至10 mL量瓶中，搖勻，濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取“2.1.2”及“2.2.2”項下對照品溶液適量，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取對照品混合溶液10 μL，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.23%、0.27%、0.12%、0.32%、0.19%、0.13%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取藥材粉末6份，按“2.1.3”及“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.24%、0.92%、0.34%、0.57%、0.26%、0.11%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液，于0、4、8、12、16、24 h分別在“2.1.1”及“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，測得大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷峰面積RSD分別為0.21%、0.74%、0.65%、0.42%、0.31%、0.24%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為1.112 3、0.357 8、0.541 2、0.246 5、0.177 5、0.165 8 mg/mL的溶液。取藥材粉末6份，每份約0.05 g，精密稱定，精密加入上述溶液適量，按“2.1.3”及“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，大車前苷、鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃葉珊瑚苷平均加樣回收率分別為95.5%、97.7%、99.6%、100.2%、101.9%、100.3%，RSD分別為1.80%、0.83%、1.94%、1.85%、0.95%、0.82%。

2.3.6 樣品含量測定 精密稱取藥材粉末(過3號篩)0.1 g，平行2份，按“2.1.3”及“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在“2.1.1”及“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

2.3.7 聚類分析 采用SPSS 25.0軟件進行聚類分析，選擇組內聯接聚類法，以歐式平方距離度量為標準，結果見圖3。由此可知，當歐式平方距離為10時，第1類全部聚成一類；第二類分別聚類，未與第1類、第3類交叉；第3類也分別聚類，未與第1類、第2類交叉。

2.3.8 正交偏最小二乘法判別分析 采用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘法判別分析，結果見圖4。由此可知，各批藥材地上、地下部分中6種成分分別聚集，具有一定的差異性。

圖4 正交偏最小二乘法判別分析得分圖Fig.4 Score diagram for orthogonal partial least-squares discrimination analysis

3 討論

由于梓醇、桃葉珊瑚苷色譜條件與鞭打繡球苷B、10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇色譜條件具有明顯差異，故本實驗分別建立其含量測定方法。聚類分析結果表明，3種形態全緣兔耳草不同藥用部位中6種成分分布具有一定差異。表3顯示，第1類藥材中梓醇、桃葉珊瑚苷含量低于另外2類藥材；第3類藥材中鞭打繡球苷B，10-O-反式-對甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇)含量低于第1、2類藥材，但大車前苷含量更高；3類藥材中苯乙醇苷類總含量接近，而環烯醚萜苷類總含量依次為第3類>第2類>第1類，這可能與其生長環境(如海拔、溫度等)相關。

表3 各成分含量測定結果(mg/mL，n=2)

正交偏最小二乘法判別分析是一種用于判別分析的多變量統計分析方法，可用于觀察不同產地樣品之間的組內差異，進行有監督的判別分析[18]，并獲得相應模型。本實驗發現，3種形態全緣兔耳草的6種成分含量在地上、地下部分中具有差異，但同一藥用部位不同批次藥材的點較為分散；地上部分中苯乙醇苷類總含量均高于地下部分，而環烯醚萜苷類總含量恰好相反。