江南星蕨中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

李善斌， 黃四新， 牟俊飛， 羅 琴， 梁成欽， 周先麗*

(1.桂林醫學院生物技術學院，廣西 桂林 541004；2.桂林醫學院藥學院，廣西 桂林 541004)

隨著人們生活水平的提高，糖尿病患者迅速增加，特別是廣大發展中國家[1]。在已知的疾病中糖尿病死亡率高居第3位，僅次于腫瘤和心腦血管疾病[2]。全球約有4.25億糖尿病患者，而我國擁有數量世界第二的糖尿病患者[3-4]，大多數為2型糖尿病。對于2型糖尿病患者，控制餐后血糖可以有效的防止一系列糖尿病癥的發生[5]。

葡萄糖苷酶在生物體內主要是通過水解糖類中的葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，葡萄糖苷酶對于調節餐后血糖具有決定性作用，按照其功能分為α-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶[6]。目前臨床上常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑(AGIs)，例如阿卡波糖、米格列醇等[7]，AGIs本身存在一定毒副作用，因此，從天然植物中開發新型、高效、低毒的AGIs對于2型糖尿病的防治具有重要意義[8]。

江南星蕨Microsorumfortunei為水龍骨科植物，用于疔毒、蛇蟲咬傷、燒傷等癥[9-10]，江南星蕨含有糖、酚酸、黃酮等多種活性成分[11]，同時還具有較強的抗菌和抗氧化活性[12-14]，但目前對于其中α-葡萄糖苷酶抑制活性的報道較少。本研究對該藥材中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛對α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究，以期為其進一步開發利用提供依據。

1 材料

1.1 藥材與試劑 江南星蕨采于廣西資源縣，經桂林醫學院李云秋教授鑒定為正品。阿卡波糖(上海梯希愛化成工業發展有限公司)；二甲基亞砜(西隴科學股份有限公司，批號1709101)；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(美國Sigma公司)。

1.2 儀器 酶標儀(美國Bio-Teck公司)；FE28 PH計、電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 化合物提取分離 參照文獻[3]報道，江南星蕨干燥粉碎后用75%乙醇提取1 h，重復2次，乙酸乙酯萃取后正丁醇萃取，得到2個組分，經硅膠柱層析，分別得到組分Fr.A～Fr.F、Fr.I～Fr.Ⅵ。Fr.B經MCI柱，90%甲醇洗脫，Sephadex LH-20柱分離，得到組分Fr.B.1～Fr.B.5，Fr.B.4經中壓反相硅膠柱色譜分離，10%～100%甲醇洗脫，得到原兒茶酸。再采用MCI柱分離Fr.Ⅱ組分，甲醇洗脫，得到組分Fr.Ⅱ.1～Fr.Ⅱ.4，Fr.Ⅱ.1經反相硅膠柱、RP-HPLC制備色譜分離，得到5-羥甲基-2-呋喃甲醛。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 反應體系參照文獻[15]，以阿卡波糖為陽性對照，2個化合物用DMSO溶解后以pH 6.9的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.001、0.010、0.050、0.100、0.200、0.500 mg/mL，分別取50 μL至96孔板中，加入100 μL 0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶混勻，置于25 ℃孵育箱中15 min，加入50 μL 5 mmol/L pNPG，在25 ℃下孵育10 min，在405 nm波長處測定吸光度(A)，計算酶活性抑制率，公式為抑制率=[(A0-A1)/A0]×100%，其中A0為空白組吸光度，A1為樣品組吸光度。

2.3 酶抑制動力學研究 參考文獻[16]報道，設置化合物質量濃度為0.5 mg/mL，測定在反應時間1、5、10、15、20 min時化合物在反應時間對酶活性的影響。在化合物質量濃度分別為0、0.5 mg/mL時，改變α-葡萄糖苷酶濃度為0.24、0.36、0.48、0.60 U/mL，測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，并判斷其抑制作用的可逆性[17]。取0.5、1、1.7、2 mmol/L pNPG與不同質量濃度2個化合物，測定反應速率，繪制化合物的Lineweaver Burk酶抑制動力學曲線，確定抑制作用類型[18]。

3 結果

3.1 化合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 由圖1可知，原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制率與質量濃度呈正相關，兩者和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率分別為55.46%、68.77%、91.72%，其IC50值分別為(0.090±0.029)、(0.002±0)、(0.105±0.013)mg/mL。

圖1 各化合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率

圖2 各化合物反應時間-酶活性曲線

3.2 酶抑制動力學 由圖2可知，2個化合物質量濃度在0.5 mg/mL時，酶活性抑制率在1 min內達到峰值，隨后下降。由圖3～5可知，隨著抑制濃度增加，2個化合物、阿卡波糖直線斜率逐漸減小，表明酶活力降低是由于酶活力受到影響，與酶量減少無關，即三者均為可逆性抑制。由圖6～8可知，反應體系中改變抑制劑濃度基本上沒有改變Vmax，表明2個化合物、阿卡波糖對酶均呈現競爭性抑制。

圖3 原兒茶酸酶量-反應速率曲線

圖4 5-羥甲基-2-呋喃甲醛酶量-反應速率曲線

圖5 阿卡波糖酶量-反應速率曲線

圖6 原兒茶酸酶動力學抑制曲線

圖7 5-羥甲基-2-呋喃甲醛酶動力學抑制曲線

圖8 阿卡波糖酶動力學抑制曲線

4 討論

本實驗采用體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗對江南星蕨中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛進行測定，結果表明這2種化合物對α-葡萄糖苷酶抑制具有較好的功效，且抑制率隨質量濃度的增加而逐漸增大，呈濃度依賴性。通過酶動力學研究發現，其作用機制與阿卡波糖相似，都呈可逆競爭性抑制。

目前臨床應用人工合成的AGIs藥物大多存在一定的腎毒性，因此，從天然產物中篩選更安全、有效的AGIs對糖尿病新藥的研發具有重要的價值。本實驗證實江南星蕨中原兒茶酸、5-羥甲基-2-呋喃甲醛具有降低α-葡萄糖苷酶活性的作用，為江南星蕨進一步的研究與開發提供驗依據。