貞芍組分方藥對圍絕經期綜合征模型大鼠的藥效學研究

崔艷艷， 孫文君， 史 磊， 莫 梅， 劉崇序， 喬明琦， 王杰瓊,4*

(1.山東中醫藥大學藥學院,山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學情志病證研究創新團隊,山東 濟南 250355；3.山東中醫藥大學科研處，山東 濟南 250355；4.山東中醫藥大學情志病證創新中藥研究青年科研創新團隊,山東 濟南 250355；5.山東中醫藥大學實驗中心,山東 濟南 250355；6.澳門科技大學中醫藥學院，澳門 999078)

圍絕經期綜合征 (menopausal syndrome, MPS) 是指婦女圍絕經期前后由于卵巢功能衰退導致激素水平不穩定而出現的一系列軀體、心理癥狀[1]。MPS的臨床表現為潮熱、煩躁、健忘、易怒等癥狀。腎虛是MPS發病根本，為常見癥型，肝疏泄太過為主要特征[2]，主要表現為潮熱、盜汗、煩躁、月經量少等。喬明琦根據自身多年臨床經驗總結，自擬白芍和女貞子聯用法治療MPS，女貞子Fructusligustrilucidi具有滋陰補腎之效；白芍CynanchumotophyllumSchneid能夠養血柔肝，二者配伍，補益腎陰，平肝降逆，對癥下藥[3]。本實驗采用貞芍組分方藥(女貞子提取物和白芍提取物聯用)給藥，探究該方藥針對MPS的藥效學特征。

1 材料

1.1 動物 84只雌性SD大鼠，SPF級，體質量150～180 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(京)2017-0006。大鼠適應性飼養1周，晝夜顛倒，周期為明暗12 h/12 h。

1.2 藥物與試劑 黑順片(黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號D8040201)；干姜(安徽三和堂藥業有限公司，批號180101)；白芍提取物(陜西慧科植物開發有限公司，批號HK20181118，含芍藥苷50%)；女貞子提取物(山東中醫藥大學提供，含齊墩果酸44.54%)；戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司，批號J20181139)；坤寶丸(北京同仁堂股份有限公司，批號Z11020178)。大鼠β-內腓肽(β-endorphin，β-EP)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)、促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，FSH)ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E08206r、CSB-E12654r、CSB-E05110r、CSB-E08037r、CSB-E06869r)；大鼠一氧化氮(nitrogen monoxidum，NO)ELISA試劑盒(江蘇科晶生物科技有限公司，貨號YX-141500R)；反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；qPCR mix[依科賽生物科技(太倉)有限公司]；蘇木精(美國Sigma公司，批號041M0014V)；伊紅(上海邁坤化工有限公司，批號20120831)；BCA試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號PC0020)。

1.3 儀器 動物行為學分析系統、XR-SuperMaze動物行為分析系統、XR-XZ301大鼠高架十字迷宮實驗系統均購自上海欣軟信息科技有限公司。

2 方法

2.1 女貞子和白芍提取物制備及劑量篩選 女貞子提取物由山東中醫藥大學藥學院藥劑學實驗室提取、純化[4-5]，女貞子藥材用8倍量60%乙醇提取3.0 h，提取3次；白芍藥材用8倍量30%乙醇提取3.0 h，提取3次，經高效液相色譜法測得女貞子提取物含齊墩果酸44.54%，白芍提取物含芍藥苷50%。前期按照均勻設計，以女貞子提取物和白芍提取物為考察因素，以文獻[6]報道齊墩果酸用量為參考，齊墩果酸從0～125 mg /kg進行六級遞增，分別為0、25、50、75、100、125 mg/kg；按照更舒方中配比，生藥女貞子和白芍配比為1∶1，女貞子含齊墩果酸0.6%，白芍含芍藥苷1.2%，故齊墩果酸和芍藥苷比例為1∶2，芍藥苷從0～250 mg /kg進行六級遞增，分別為0、50、100、150、200、250 mg /kg。按照均勻設計表安排各因素及水平，進行組方設計，得到均勻設計方案，見表1。設溶媒組、模型組、假手術組、坤寶丸組、戊酸雌二醇組共5個對照組，及貞芍組分方藥1、2、3、4、5、6組6個給藥組，灌胃28 d，以血清中E2水平為指標，根據實驗結果并參考文獻[7]確定貞芍組分方藥低劑量組為女貞子提取物112 mg/kg、白芍提取物100 mg/kg，中劑量組為女貞子提取物225 mg/kg、白芍提取物200 mg/kg，高劑量組為女貞子提取物449 mg/kg、白芍提取物400 mg/kg；戊酸雌二醇組劑量為0.1 mg/kg；坤寶丸組劑量為1 mg/kg。采用1 mL甘油濕潤藥物，然后用0.5% CMC-Na配成相應溶液，每天灌胃2.5 mL，連續給藥4周，模型組和假手術組灌胃等容量0.5% CMC-Na溶液。

表1 女貞子提取物和白芍提取物配伍均勻設計劑量表(mg/kg)

2.2 MPS大鼠模型制備與分組 大鼠隨機分為假手術組和造模組，造模組大鼠手術摘除卵巢，7 d后采用陰道電阻法檢測，剔除不合格大鼠；14 d后，造模組灌胃給予附子干姜溶液(附子、干姜各50 g，加水煎煮至100 mL)，劑量為10 mg/kg，模型組灌胃等容量蒸餾水，連續7 d[7]，將造模組大鼠隨機分為模型組、假手術組、坤寶丸組、戊酸雌二醇組及貞芍組分方藥低、中、高劑量組。

2.3 取材 大鼠斷頭處死，取腹主動脈血，低溫離心取血清保存于冰箱；取全腦后迅速剝離下丘腦、垂體，于液氮中速凍后，轉移至-80 ℃冰箱保存；取子宮，計算子宮指數后，一部分固定于4%甲醛，另一部分于液氮中速凍后，轉移至-80 ℃冰箱保存。

2.4 大鼠體質量增長情況記錄 實驗開始后，每周記錄大鼠體質量，并計算體質量增長量，體質量增長量=給藥后體質量-給藥前體質量。

2.5 高架十字迷宮實驗 開始實驗時, 將大鼠放置在開放臂與閉合臂重合的部位，記錄大鼠5 min內進入開放臂與閉合臂的次數和時間，并計算開放臂進入次數百分比和開放臂停留時間百分比。

2.6 ELISA法檢測血清、下丘腦、垂體激素水平 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中E2、β-EP、NO水平，下丘腦GnRH水平，垂體LH、FSH水平。

2.7 HE染色檢測子宮內膜病理學 將子宮于4%甲醛中固定72 h，經脫水、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟、HE染色、封片后，檢測其內膜層厚度。

2.8 免疫熒光法檢測大鼠子宮雌激素受體(ER)α、β蛋白表達 子宮石蠟切片標本脫蠟水化，進行抗原修復，加入熒光淬滅劑，沖洗，牛血清封閉30 min，甩去封閉液，加一抗，4 ℃過夜，加二抗，避光常溫孵育50 min，沖洗，加入DAPI復染，封片后，顯微鏡下觀察，并以積分光密度值(IOD值)代表蛋白表達強度。

2.9 RT-qPCR法檢測子宮組織ERα、ERβmRNA表達 液氮研磨子宮后，加入Trizol提取總RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，cDNA與引物按照條件進行擴增。反應條件為95 ℃預變性15 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環，以β-actin作為內參，采用2-△△CT法計目的基因相對表達。引物序列分別為β-actin正向5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′；ERα正向5′-AGTG GGCATGATGAAAGGCG-3′，反向5′-AGGGCGGGGC TATTCTTCTT-3′；ERβ正向5′-TATCTCCTCCCAGCAGCAGT-3′，反向5′-CTTGTACCCTCGAAGCGTGT-3′。

3 結果

3.1 均勻設計法篩選貞芍組方最佳配比 與溶媒組比較，假手術組大鼠血清E2水平無明顯變化(P>0.05)；與假手術組比較，模型組大鼠血清E2水平降低(P<0.05)；與模型組比較，貞芍組分方藥3、5組大鼠血清E2水平均升高(P<0.05)，見圖1。

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖1 各組大鼠血清E2水平的影響

3.2 貞芍組分方藥對MPS大鼠體質量的影響 給藥4周后，與假手術組比較，模型組大鼠體質量增加(P<0.01)；與模型組比較，貞芍組分方藥高劑量組大鼠的體質量增長減慢(P<0.01)，見表2。

表2 貞芍組分方藥對大鼠體質量的影響

3.3 貞芍組分方藥對MPS大鼠高架十字迷宮得分的影響 如圖2所示，與假手術組比較，模型組大鼠進入開放臂次數百分比降低(P<0.05)；與模型組比較，戊酸雌二醇組大鼠進入開放臂次數百分比增加(P<0.05)，貞芍組分方藥高劑量組進入開放臂次數百分比及時間百分比均增加(P<0.05)。

注：與假手術組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。圖2 各組大鼠高架十字迷宮實驗得分

3.4 貞芍組分方藥對MPS大鼠血清E2、β-EP、NO水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清中E2、β-EP、NO水平降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，戊酸雌二醇組及貞芍組分方藥中、低劑量組大鼠血清E2水平升高(P<0.05，P<0.01)，貞芍組分方藥高、中劑量組大鼠血清β-EP水平升高(P<0.05)，貞芍組分方藥高、低劑量組大鼠血清NO水平升高(P<0.05)，見圖3。

3.5 貞芍組分方藥對MPS大鼠下丘腦、垂體中激素水平的影響 如圖4所示，與假手術組比較，模型組大鼠下丘腦GnRH水平、垂體FSH和LH水平均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，坤寶丸組、戊酸雌二醇組和貞芍組分方藥各劑量組下丘腦GnRH水平、垂體LH水平均降低(P<0.05，P<0.01)，戊酸雌二醇組大鼠腦組織中垂體FSH水平降低(P<0.05)。

3.6 貞芍組分方藥對MPS大鼠子宮指數及內膜形態的影響 與假手術組比較，模型組大鼠子宮可見較明顯萎縮，子宮內膜層變薄(P<0.01)，子宮指數降低(P<0.01)；與模型組比較，戊酸雌二醇組和貞芍組分方藥高劑量組大鼠子宮指數升高(P<0.05，P<0.01)，子宮內膜層厚度無明顯變化(P>0.05),見圖 5。

注：與假手術組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組大鼠血清E2、β-EP、NO水平

注：與假手術組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組大鼠腦組織中GnRH、FSH、LH水平

注：與假手術組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組大鼠子宮形態(A)、子宮指數(B)及內膜層厚度(C)(HE染色，

3.7 貞芍組分方藥對MPS大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織ERα、ERβ蛋白表達均降低(P<0.01)；與模型組比較，戊酸雌二醇組與貞芍組分方藥高、中劑量組大鼠子宮組織ERα蛋白表達均升高(P<0.01)，貞芍組分方藥各劑量組ERβ表達均升高(P<0.05，P<0.01)，見圖6。

注：與假手術組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖6 各組大鼠子宮ERα、ERβ免疫熒光染色(A、B)及IOD值

3.8 貞芍組分方藥對MPS大鼠子宮組織ERα、ERβmRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織ERαmRNA表達降低(P<0.01)，ERβmRNA表達有降低趨勢，但無統計學差異(P>0.05)；與模型組比較，戊酸雌二醇組和貞芍組分方藥高劑量組大鼠子宮組織ERαmRNA表達升高(P<0.05)，貞芍組分方藥各組大鼠子宮組織ERβmRNA表達有升高趨勢，但無統計學差異(P>0.05)，見圖7。

注：與假手術組比較,##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。圖7 各組大鼠子宮組織中ERα、ERβ mRNA表達

4 討論

本實驗通過檢測行為學和微觀指標對MPS的主要臨床表現及生理病理變化進行驗證，與模型組比較，貞芍組分方藥給藥后，大鼠的焦慮樣行為得到改善，體質量增長得到控制，從表觀和微觀指標可以看出，大鼠的子宮指數上調，子宮萎縮得到改善，E2、β-EP、NO水平升高，FSH、LH、GnRH水平降低，貞芍組分方藥可以較好地改善MPS腎虛肝逆證煩躁易怒、子宮退行性病變等臨床表現。根據均勻設計結果，發現貞芍組分方藥3、5組能提高大鼠血清中E2水平，查閱文獻后決定采用3組的劑量為本實驗用低劑量[7]。

圍絕經期婦女卵巢早衰，性激素波動，下丘腦-垂體-卵巢軸(HPGA)紊亂[8]，導致GnRH、LH、E2分泌異常[9]。圍絕經期婦女體內雌激素分泌減少,代謝障礙,更易產生肥胖，雌激素具有調節脂代謝的作用,MPS婦女肥胖的發病與雌激素減少相關[10]。研究表明，女貞子、白芍能升高雌激素水平[11-12]。本實驗結果顯示，經貞芍組分方藥治療后，各組GnRH、LH水平降低，E2水平升高，體質量增長得到控制。因此，貞芍組分方藥可能具有雌激素樣作用，通過平衡HPGA發揮治療效果。

面對高架十字迷宮的開臂和閉臂，動物有探究與回避的矛盾行為，進入開臂次數百分比和進入開臂時間百分比數值下降時，動物出現焦慮心理[13-14]。白芍具有疏肝解郁的功效，對焦慮癥有較好的治療效果[15]。本實驗結果顯示，貞芍組分方藥組大鼠進入開臂次數百分比和進入開臂時間百分比均升高，證明二者聯用可改善焦慮情緒。

圍絕經期婦女常見子宮萎縮，子宮內膜變薄[16]，研究表明，女貞子有改善子宮萎縮的作用效果[17]。與模型組比較，用藥后貞芍組分方藥各劑量組子宮指數均升高，改善了子宮萎縮及子宮內膜變薄情況。

綜上所述，貞芍組分方藥可能具有雌激素樣作用，但是貞芍組分方藥雌激素樣作用及其具體機制尚需進一步探討。