復方五鳳草液對創面愈合和巨噬細胞極化的影響

高璐玨， 黃子慧， 朱思洵， 高敏行， 錢佳燕， 孫佳玥， 陳曉鈺， 余 洋

(南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院，江蘇 南京 210014)

慢性難愈性創面的修復是臨床上常見的難題，創面通常深達真皮和皮下組織，且面積較大，病程遷延，是一種長期消耗性疾病，有很高的致殘率[1]。長期不愈合的創面甚至會有癌變的風險，造成嚴重后果。且慢性創面的患者多合并有糖尿病、高血壓病等基礎疾病，手術治療風險大[2-3]。中醫藥在創面修復方面具有獨特而鮮明的優勢[4-5]。慢性創面屬于中醫“瘡瘍”范疇，結合多年的臨床實踐，提出泄毒生新法，并自創復方五鳳草液，在對多種慢性創面臨床治療中效果顯著。在下肢靜脈性、燒傷性、壓力性以及糖尿病創面的4種大鼠模型上得到了驗證[6]，對于復方五鳳草液具體的作用機制尚不清楚。本實驗通過構建巨噬細胞模型，建立慢性難愈性創面大鼠模型，觀察復方五鳳草液對巨噬細胞極化的影響及與創面愈合之間的關聯，探索復方五鳳草液泄毒生新的機制。

1 材料

1.1 藥物 復方五鳳草液為南京中醫藥大學附屬南京市中西醫結合醫院院內制劑。其制備工藝為稱取五鳳草2 000 g、白及240 g、貓爪草400 g，加水浸過藥面，煎煮3次，每次1 h，合并濾液，濃縮成含生藥量為2 500 mg/mL的溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，于4 ℃冰箱保存。以上藥液均由南京市中西醫結合醫院中藥制劑室提供。

1.2 細胞株及動物 U937人組織細胞淋巴瘤細胞購自中國科學院細胞庫。清潔級SD大鼠，體質量180～200 g，雄性，由南京市江寧區青龍山動物養殖場提供，實驗動物生產許可證號SCXK(蘇)2017-0001，單籠飼養于南京中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室，自由飲水、攝食，室溫(22±1)℃。

1.3 試劑 佛波醇PMA、脂多糖LPS購自美國Solarbio公司；干擾素IFN-γ、白介素IL-4、白介素IL-13均購自美國PeproTech公司；DMSO、MTT購自美國Sigma公司；細胞培養采用的RPMI 1640、胎牛血清均購自美國Gibco公司；anti-mouse CD86、CD206 FITC試劑盒購自美國eBioscience公司；人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒、人轉化生長因子β(TGF-β)ELISA試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司；Arg-1抗體、iNOS抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標山羊抗小鼠IgG(H+L)、SYBRGreen均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.4 儀器 SpectraMax M3多功能酶標儀購自美國Molecular Devices公司；MIKRO220R高速低溫離心機購自德國Hettich公司；Nanodrop-one二氧化碳培養箱購自美國賽默飛公司；DK-S24水浴鍋購自上海精宏公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；LightCycler 480熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏公司；Nanodrop1000微量分光光度計購自美國Bio-Tek公司；IX53倒置熒光顯微鏡、CKX41組織培養用顯微鏡購自日本Olympus公司；7S-1水平搖床購自海門市其林貝爾有限公司；SFPS-2448高速勻漿機購自杭州博日科技股份有限公司；ELGA超純水儀購自英國Purelab公司；EZ Imager凝膠成像圖像分析系統購自美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 細胞實驗

2.1.1 細胞的培養及誘導 U937單核細胞用含10%FBS 和1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養基，于37 ℃、50 mL/L CO2培養箱中培養。建立參與炎癥和免疫應答的M0、M1、M2型巨噬細胞模型，在6孔板中接種U937細胞，每孔3×105個細胞，100 ng/mL PMA誘導24 h，建立未活化型U937-M0細胞；200 ng/mL LPS及20 ng/mL IFN-γ誘導36 h，得到經典活化型U937-M1細胞；40 ng/mL IL-4及20 ng/mL誘導36 h，得到經典活化型U937-M2細胞。

2.1.2 細胞活力檢測 取對數期生長的U937細胞，以4×104/mL密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，用PMA誘導得到U937-M0細胞，分別用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL復方五鳳草液處理，對照組為U937細胞不加藥物，繼續培養24 h后，每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)，4 h后吸棄上清，每孔加150 μL DMSO，待結晶物完全溶解后，檢測光密度(OD)值，計算細胞存活率。

2.1.3 實驗分組 藥物干預組根據MTT結果進行分組，M1細胞極化干預分為3組，分別為LPS及IFN-γ與1.0、1.5、2.0 mg/mL復方五鳳草液共處理組；M2細胞極化干預分為3組，分別為IL-4及IL-13與1.0、1.5、2.0 mg/mL復方五鳳草液共處理組；設3組對照，分別為巨噬細胞不加藥物組(對照組)、LPS及IFN-γ誘導組(M1組)、IL-4及IL-13誘導組(M2組)。各組均處理36 h后收集細胞。

2.1.4 CD86、CD206表達檢測 細胞以2×105/mL密度鋪板，先用PMA處理24 h，再用LPS/IFN-γ或IL-4/IL-13誘導極化。加入不同劑量復方五鳳草液，作用36 h后，收集細胞至流式管，染FVS，孵育Fc，根據樣本數配置合適體積。加入50 μL含FITC標記的CD86抗體和PE標記的CD206抗體Staining Buffer混勻，避光孵育30 min，清洗細胞，棄上清，200 μL含1%多聚甲醛的Staining Buffer重懸，上機檢測。

2.1.5 iNOS、Arg-1表達檢測 按“2.1.4”項下方法給藥干預，收集處理后的細胞，用預冷PBS洗滌細胞，放射免疫沉淀法并加入蛋白酶抑制劑裂解提取總蛋白，參照BCA試劑盒說明書進行蛋白定量，電泳、轉膜、孵育一抗、二抗后，并以ECL顯影，掃描膠片并保存。用Quantity One軟件分析灰度值，以β-actin為內參，計算iNOS、Arg-1蛋白的相對表達。

2.1.6 細胞上清液中TNF-α、TGF-β水平檢測 按“2.1.4”項下方法給藥干預，收集細胞上清液后，使用ELISA試劑盒，通過夾心酶聯免疫吸附檢測巨噬細胞培養上清液中TNF-α、TGF-β水平。

2.2 動物實驗

2.2.1 模型制備 參照趙京禹等[7]全層皮膚缺損法，在此基礎上經腹腔注射醋酸氫化可的松注射液。

2.2.2 分組與處理 選取造模成功的大鼠12只，隨機分為模型組、復方五鳳草液組，每組6只。模型組，創面采用凡士林常規換藥處理；復方五鳳草液組，復方五鳳草液外用換藥，操作為剪取適當棉片，以該液體2 mL浸濕外敷，無菌紗布包裹固定。造模成功后創面自然暴露1 d，第2天即實驗開始，記作實驗第1天，開始進行藥物干預，實驗周期為14 d，每日換藥2次。

2.2.3 樣本采集與處理 分別于第1、3、7、14天換藥時取創緣與正常組織交界處肉芽組織標本，取材完畢后立即保存于-80 ℃冰箱。

2.2.4 創面愈合情況觀察及檢測 建模后第1、3、7、14天對小鼠局部創面進行拍照，使用Image J軟件統計傷口面積。腐肉量=(腐肉壞死組織面積/目前創面面積)×100%；肉芽量=(新生肉芽面積/目前創面面積)×100%；創面愈合率=[(原始創面面積-時相點未愈合面積)/原始創面面積]×100%。

2.2.5 RT-qPCR檢測組織中iNOS、Arg-1的mRNA表達 將組織室溫解凍，使用全自動組織勻漿機研磨組織，每次勻漿30 s，間隔2 min，于冰上靜置，直至無明顯塊狀組織，將研磨后的組織轉移至離心管中，4 ℃，2 500×g離心20 min，收集上清液，提取創面組織中總RNA，逆轉錄得到cDNA，按照 All-in-oneTM Mix試劑盒說明書，分別進行實時熒光PCR檢測iNOs、Arg-1表達。引物由美國Genecopoeia公司設計合成。

2.2.6 組織中細胞因子水平檢測 收集組織勻漿后的上清液，使用ELISA試劑盒，通過夾心酶聯免疫吸附檢測TNF-α、TGF-β水平。

3 結果

3.1 細胞實驗

3.1.1 M0、M1、M2細胞模型圖 對U937單核細胞進行誘導，得到M0、M1、M2細胞模型，見圖1。懸浮的U937細胞經PMA誘導后，向巨噬細胞分化，可見大量細胞黏附在培養板底，并有一些細胞長出小的突起；LPS及IFN-γ促使M0型巨噬細胞生成更多的突起，可形成梭形；IL-4及IL-13對U937巨噬細胞樣細胞的形態無明顯影響。

圖1 巨噬細胞模型圖

3.1.2 復方五鳳草液對細胞活力的影響 與對照組比較，M1組(M0+LPS/IFN-γ)和M2組(M0+IL-4/IL-13)的細胞存活率無明顯變化(P>0.05)；當復方五鳳草液的質量濃度達到2.5 mg/mL時，細胞存活率降低(P<0.05)。故選擇1.0、1.5、2.0 mg/mL作為實驗劑量，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 復方五鳳草液對巨噬細胞活力的影響

3.1.3 復方五鳳草液對M1和M2型巨噬細胞表面標志分子表達的影響 與對照組比較，LPS和IFN-γ誘導巨噬細胞極化導致M1型標志分子iNOS、TNF-α的蛋白表達升高(P<0.05)，表明誘導其向M1極化；IL-4和IL-13誘導巨噬細胞極化導致M2型標志分子Arg-1、TGF-β的相對表達升高(P<0.05)，表明誘導其向M2極化。1.0、1.5、2.0 mg/mL復方五鳳草液干預M1巨噬細胞后，M1型炎性因子的表達無明顯變化(P>0.05)；復方五鳳草液干預后的M2型標志分子的表達升高(P<0.05)，且2.0 mg/mL劑量作用最佳，見圖3～4。

3.1.4 復方五鳳草液對極化巨噬細胞表面分化群CD86和CD206的影響 M1細胞表面分化群CD86的平均熒光強度在對照組和M2組的水平較低，而M1組的水平較高，且不同質量濃度復方五鳳草液的處理不影響CD86表達；M2細胞表面分化群CD206的平均熒光強度在對照組和M1組的水平較低，而M2組的水平較高，且隨著復方五鳳草液質量濃度的增加，CD206的表達增強。見圖5～6。

3.2 動物實驗

3.2.1 2組小鼠創面宏觀觀察比較 給藥初期，2組小鼠創面均有膿性分泌物，腐肉附著，肉芽蒼白質脆。給藥過程中，2組膿液量、腐肉量漸減少，創面面積漸縮小。治療第7天，復方五鳳草液組肉芽鮮紅致密，創面無滲液、腐肉，創緣再上皮化，傷口愈合趨勢明顯；而模型組創面仍有少量腐肉，肉芽水腫。第14天，復方五鳳草液組創面結痂、愈合；模型組創面肉芽新鮮，無明顯滲液，創面面積縮小，尚未愈合。復方五鳳草液組在第7、14天腐去速度、上皮增長速度、創面愈合速度均優于模型組，見圖7。

注：與對照組比較， *P<0.05；與M2組比較，#P<0.05；與M2+1.0 mg/mL復方五鳳草液組比較，&P<0.05。圖3 復方五鳳草液對活化巨噬細胞iNOS、Arg-1蛋白表達的影響

3.2.2 復方五鳳草液對創面愈合率、肉芽量及腐肉量的影響 與上一時間點比較，2組小鼠創面在第7、14天的愈合率和肉芽量均增加，腐肉量減少(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，復方五鳳草液組小鼠創面的的愈合率和肉芽量在第7、14天均增加，腐肉量減少(P<0.05,P<0.01)，見表1～3。

3.2.3 復方五鳳草液對創面組織中相關因子水平的影響 模型組中M1型炎性因子iNOSmRNA表達和TNF-α水平在第3、7天升高(P<0.05)，第14天也處于較高水平；M2型標志分子Arg-1 mRNA表達和TGF-β水平在第1、3、7天無明顯變化(P>0.05)，在第14天時升高。復方五鳳草液組中M1型炎性因子iNOSmRNA表達和TNF-α水平在第3天時達到最高，并在第7、14天降低；M2型標志分子Arg-1 mRNA表達和TGF-β水平在第7、14天逐漸升高。與模型組比較，復方五鳳草液組iNOSmRNA表達和TNF-α水平在第7、14天降低(P<0.01)；與模型組比較，復方五鳳草液組Arg-1 mRNA表達和TGF-β水平在第7、14天升高(P<0.05)，見圖8～9。

注：與對照組比較， *P<0.05；與M2組比較，#P<0.05；與M2+1.5 mg/mL復方五鳳草液組比較，&P<0.05。圖4 復方五鳳草液對活化巨噬細胞TNF-α、TGF-β水平的影響

圖5 復方五鳳草液對巨噬細胞M1極化CD86表達的影響

圖6 復方五鳳草液對巨噬細胞M2極化CD206表達的影響

圖7 兩組小鼠創面對比

表1 2組小鼠創面愈合率比較

表2 2組小鼠創面肉芽量比較

表3 2組小鼠創面腐肉量比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與前一時間點比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖8 小鼠創面組織中iNOS和Arg-1的mRNA表達

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與前一時間點比較，△P<0.05，△△P<0.01。圖9 小鼠創面組織中TNF-α和TGF-β的水平

4 討論

慢性難愈性創面指在單因素或多因素共同作用下導致皮膚缺損、破壞，經長時間規范治療，其解剖及功能未達到完整狀態且無愈合傾向的創面[8]。在歐美發達國家，糖尿病足、褥瘡及下肢動靜脈潰瘍等是中老年人面臨的重要危害之一。隨著我國老齡化的不斷加重及糖尿病、高血壓等基礎疾病的持續上升，難愈性創面修復問題亟需解決[9-10]。

中醫藥在促進創面修復中發揮著巨大作用。周代有“瘍醫”的劃分，歷代有“煨膿長肉”“祛腐生新”“肌平皮長”等理論[11]。復方五鳳草液中五鳳草有行水殺蟲，祛腐解毒功效[12]；白芨有斂瘡消腫，生肌止血功效[13]；貓爪草有拔膿解毒，活血消腫功效[14]。諸藥合用，使“泄毒”“生新”2者相得益彰，臨床運用多年，療效滿意。

在慢性創面修復中，巨噬細胞起到重要作用[15]，不同微環境下巨噬細胞可極化為M1和M2兩種類型[16]，M1型參與炎癥產生的起始和維持；M2型參與組織修復。受到信號激活的巨噬細胞可存在于M1/M2之間的任一中間階段，且具有較強的可塑性。在慢性難愈性創面中，巨噬細胞功能和表型轉換紊亂，M1/M2極化失衡，出現M1型募集、M2型損耗的混合極化狀態[17]。M2型巨噬細胞的活化能有效減輕M1型巨噬細胞引發的血管免疫損傷，對于炎癥反應后期的組織損傷具有修復和重塑作用[18-19]。M1向M2型轉換是創面由炎癥反應轉為修復性反應的關鍵[20]。M1極化的巨噬細胞產生促炎性細胞因子和介質，導致炎癥[21]，而M2巨噬細胞支持傷口愈合和炎癥消退[22]。在對M0誘導過程中，M1、M2始終處于一種共存的狀態。在慢性炎癥疾病的不同階段，巨噬細胞亞型的主導地位在時間上是動態的[23]。M1型和M2型巨噬細胞無法如正常創面進行時過渡，在臨床中則表現為難愈創面中異常炎癥滯留和新生肉芽組織減少的狀態[24]。從慢性創面愈合過程中的巨噬細胞活化角度[21]，選取M1表型指標iNOS、TNF-α以及M2表型指標Arg-1、TGF-β進行實驗，發現復方五鳳草液可促進IL-4+IL-13誘導的M2極化；復方五鳳草液干預后期，M2型相關因子水平升高。提示，復方五鳳草液可能通過調節巨噬細胞M1、M2的極化對慢性難愈性創面發揮修復作用。

綜上所述，復方五鳳草液可能通過抑制巨噬細胞M1型向M2型極化發揮其泄毒生新效用。