鉤藤堿對人絨毛膜滋養層細胞增殖、遷移和侵襲的影響

肖艷平， 付久園， 王曉華， 葛永梅， 朱艷菊

(承德醫學院附屬醫院，河北 承德 067000)

子癇前期是妊娠相關綜合征，其特征在于妊娠20周后出現高血壓和蛋白尿，影響約4%的妊娠，占全世界孕產婦死亡率的15%以上[1]。人胎盤滋養層細胞的正常增殖和遷移對于維持胎盤的正常功能極為重要[2]。研究發現，滋養細胞浸潤和遷移不足會導致血管重塑受損和胎盤早期循環減少，從而導致妊娠20周后引起胎盤缺血，促進子癇前期的發生和進展[3]。因此，有效抑制滋養層細胞增殖、遷移和侵襲對子癇前期的臨床治療具有重要意義。目前治療子癇前期的主要方法包括解痙、鎮靜，有指征的降壓、利尿[4]。鉤藤是茜草科鉤藤屬植物，以帶鉤的莖枝入藥，具有清熱、定驚和降壓的功效，常用于治療頭痛眩暈、驚癇抽搐、妊娠子癇等[5-6]。目前研究顯示，鉤藤在重度子癇前期的臨床治療中能夠明顯減輕患者的癥狀，且療效確切[7]。因此，本實驗探究鉤藤中有效活性成分鉤藤堿對滋養層細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo購自美國模式培養物集存庫。

1.2 試劑與藥物 鉤藤堿對照品(純度≥98%，批號A0318)購自成都曼思特生物科技有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國HyClone公司；CCK-8檢測試劑購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；細胞周期檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；孔徑為8 μm的Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司；NF-κB p65、IκBα、p-IκBα抗體和HRP標記的二抗購自美國CST公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發光試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；實驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 細胞培養和分組 HTR-8/SVneo細胞培養在含10%胎牛血清及100 U/mL青-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養基中，培養條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度，及時觀察細胞生長狀態，每2 d換液1次，細胞呈單層融合時，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。對數期的HTR-8/SVneo細胞分為空白對照組、鉤藤堿低劑量組和鉤藤堿高劑量組，其中鉤藤堿低、高劑量組分別加入100、400 μmol/L的鉤藤堿(根據預實驗結果選擇加藥標準濃度)，空白對照組HTR-8/SVneo細胞不做處理。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖率 對數期的HTR-8/SVneo細胞接種于96孔板中，每孔2×104個細胞，于37 ℃培養箱培養，細胞單層融合度至50%時，按照“1.3”項下分組和處理，分別在24、48、72 h時向每孔細胞中加入20 μL CCK-8溶液，繼續孵育4 h，使用多功能酶標儀在450 nm波長處檢測光密度值(OD)，并計算細胞增殖率。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期 對數期的HTR-8/SVneo細胞接種于96孔板中，按照“1.3”項下分組和處理，48 h后收集各組HTR-8/SVneo細胞，用預冷的PBS洗滌細胞3次，加入70%乙醇固定細胞，隨后用PI染色液在37 ℃下避光染色30 min，通過流式細胞儀分析染色細胞的細胞周期分布情況。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移率 對數期的HTR-8/SVneo細胞接種于6孔板中，按照“1.3”項下分組和處理，待細胞呈單層匯合時，使用滅菌的槍頭進行劃痕，用PBS洗去細胞及碎片，放置在37 ℃培養箱繼續培養48 h，分別在0、48 h獲取圖像，計算各組HTR-8/SVneo細胞遷移率。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 對數期的HTR-8/SVneo細胞按照“1.3”項下分組和處理，將細胞懸浮于含1%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，將細胞懸液加入孔徑為8 μm的Transwell小室上室(上室經Matrigel基質膠包被)，在下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液，在37 ℃培養箱孵育24 h，細胞穿膜至Transwell小室的下層，以多聚甲醛固定，結晶紫染色，通過倒置顯微鏡觀察并統計，每個小室隨機選擇5個視野進行計數。

1.8 RT-qPCR檢測細胞相關基因表達 對數期的HTR-8/SVneo細胞按照“1.3”項下分組和處理48 h后，收集各組細胞并采用Trizol試劑抽提總RNA，經超微量核酸蛋白檢測儀檢測RNA的純度和濃度，選取合格的RNA作模板，按照逆轉錄試劑盒使用說明將RNA逆轉錄合成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行PCR擴增反應，分別獲取目的基因和內參基因的CT值，以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量。Vimentin正向引物序列5′-AGTCCACTGAGTACCGGAGAC-3′，反向引物序列5′-CATTTCACGCATCTGGCGTTC-3′；E-cadherin正向引物序列5′-CTGCCAATCCCGATGAAATTG-3′，反向引物序列5′-TCCTTCATAGTCAAACACGAGC-3′；N-cadherin正向引物序列5′-TGGGAATCCGACGAATGG-3′，反向引物序列5′-GCAGATCGGACCGGATACTG-3′；GAPDH正向引物序列5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，反向引物序列5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。

1.9 Western blot實驗檢測細胞目的蛋白的表達 對數期的HTR-8/SVneo細胞按照“1.3”項下分組和處理48 h后，收集各組細胞，加入適量RIPA細胞裂解液，于冰上裂解細胞，離心收集蛋白樣品，使用BCA檢測試劑盒對蛋白進行定量，制備10%的SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白樣品上樣，電泳分離蛋白，采用濕轉法進行轉膜，將膜放置在含5%胎牛血清的封閉液中孵育1 h，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜，次日用TBST洗膜，再加入相應二抗(1∶2 000)孵育，采用ECL化學發光顯影，以β-actin為內參蛋白，采集圖像，采用Image J軟件計算目的蛋白的相對表達。

2 結果

2.1 鉤藤堿促進HTR-8/SVneo細胞增殖 如表1所示，與空白對照組比較，鉤藤堿低劑量組細胞在48、72 h時增殖率均升高(P<0.01)，鉤藤堿高劑量組細胞在24、48、72 h時增殖率均升高(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細胞在48、72 h時增殖率升高(P<0.01)。

表1 鉤藤堿對HTR-8/SVneo細胞增殖率的影響

2.2 鉤藤堿促進HTR-8/SVneo細胞周期進程 如表2、圖1所示，與空白對照組比較，鉤藤堿各劑量組G0/G1期細胞比例減少(P<0.01)，S期細胞比例增加(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組G0/G1期細胞比例減少(P<0.01)，S期細胞比例增加(P<0.01)。

表2 鉤藤堿對HTR-8/SVneo細胞周期的影響

2.3 鉤藤堿增強HTR-8/SVneo細胞遷移能力 如表3、圖2所示，與空白對照組比較，鉤藤堿各劑量組細胞遷移率均升高(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細胞遷移率升高(P<0.01)。

圖1 各組HTR-8/SVneo細胞周期細胞比例

圖2 各組HTR-8/SVneo細胞遷移能力

表3 鉤藤堿對HTR-8/SVneo細胞遷移能力的影響

2.4 鉤藤堿增強HTR-8/SVneo細胞侵襲能力 如圖3、表4所示，與空白對照組比較，鉤藤堿各劑量組侵襲細胞數增加(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組侵襲細胞數增加(P<0.01)。

圖3 各組HTR-8/SVneo細胞侵襲能力

表4 鉤藤堿對HTR-8/SVneo細胞侵襲能力的影響

2.5 鉤藤堿誘導HTR-8/SVneo細胞發生上皮間質轉化 如圖4、表5所示，與空白對照組比較，鉤藤堿各劑量組細胞中E-cadherin表達降低(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達升高(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細胞中E-cadherin表達降低(P<0.01)，N-cadherin、Vimentin表達升高(P<0.01)。

圖4 各組HTR-8/SVneo細胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達

2.6 鉤藤堿激活HTR-8/SVneo細胞中NF-κB信號通路 如圖5、表6所示，與空白對照組比較，鉤藤堿各劑量組細胞中NF-κB p65和IκBα磷酸化表達均升高(P<0.01)，IκBα表達降低(P<0.01)；與鉤藤堿低劑量組比較，鉤藤堿高劑量組細胞中NF-κB p65和IκBα磷酸化表達均升高(P<0.01)，IκBα表達降低(P<0.01)。

表5 鉤藤堿對HTR-8/SVneo細胞EMT標志分子表達量的影響

圖5 各組HTR-8/SVneo細胞中NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表達

表6 鉤藤堿對HTR-8/SVneo細胞中NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表達的影響

3 討論

子癇前期是一種妊娠并發癥，是導致孕產婦和胎兒死亡率增加的主要原因之一[8]，是由遺傳和環境因素共同作用引起的疾病[9]。目前關于子癇前期的發病機制尚不明確，有學者認為，胎盤中滋養層細胞增殖和侵襲能力不足與該病發病有關[10]。滋養層細胞的增殖對于維持胎盤正常功能具有至關重要的作用，研究顯示，子癇前期伴隨滋養層細胞的增殖能力明顯降低[11]。本實驗采用低、高劑量鉤藤堿干預人滋養層HTR-8/SVneo細胞，結果發現鉤藤堿能促進HTR-8/Svneo細胞增殖，且高劑量效果優于低劑量。此外，本實驗結果顯示，鉤藤堿可促進G0/G1期細胞向S期轉化，表明鉤藤堿能夠促進HTR-8/Svneo細胞周期進程。以上實驗結果提示，鉤藤堿能夠增強滋養層細胞增殖活力，促進細胞周期進程，對子癇前期的發病可能具有抑制作用。

上皮間質轉化(EMT)相關分子如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin，與滋養細胞的遷移和侵襲能力密切相關[12-13]，研究表明EMT在子癇前期胎盤中被抑制[14]。在絨毛頂端或附近的絨毛膜滋養層細胞失去上皮表型，并獲得間充質表型，從而賦予了細胞遷移和侵襲的能力[15]。本實驗結果顯示，鉤藤堿干預后HTR-8/Svneo細胞中E-cadherin表達降低，而N-cadherin和Vimentin表達升高，表明鉤藤堿可促進EMT過程的發生。鉤藤堿處理HTR-8/Svneo細胞后，細胞遷移和侵襲能力均升高，表明鉤藤堿能夠促進滋養層細胞的侵襲和遷移。滋養層細胞在女性懷孕期間生理上侵入子宮，并且滋養層細胞的侵襲與腫瘤細胞的侵襲行為相似[16]。以上結果表明，鉤藤堿可能通過促進EMT的發生促進滋養細胞的侵襲和遷移。多項研究表明，NF-κB信號轉導途徑參與了滋養層細胞侵襲和遷移[17-19]。在本實驗中，鉤藤堿處理后，滋養層細胞HTR-8/Svneo中IκBα的磷酸化和NF-κB信號亞基p65的表達均升高，提示鉤藤堿能夠促進NF-κB信號通路的激活。此外，研究還發現NF-κB信號通路調節EMT過程。本實驗結果表明NF-κB信號可能參與了鉤藤堿對滋養層細胞侵襲和遷移的促進作用。

綜上所述，低、高劑量鉤藤堿均可促進滋養層HTR-8/Svneo細胞的增殖，并且能夠促進細胞從G0/G1期細胞向S期轉化，促進細胞周期進程；此外，鉤藤堿還可促進EMT發生，促進HTR-8/Svneo細胞遷移和侵襲，其作用機制可能與促進NF-κB信號通路激活有關。