芒柄花黃素聯合下調miR-4326對肝癌細胞HCCLM3生長和侵襲的影響

章 涵， 趙玉霞， 楊惠然， 董 雪

(河南省信陽職業技術學院，信陽職業技術學院附屬醫院，河南 信陽 464000)

肝癌已經成為世界范圍內影響人類生命健康的惡性腫瘤之一，其發展速度快、惡性程度高，很多肝癌患者在確診時已經發生了遠端轉移，手術切除、放療等是目前肝癌治療的常見手段，這些技術手段雖然已經取得了明顯的成效，但遠遠不能滿足需求[1]。近些年來，隨著人們對腫瘤分子發生機制的不斷研究發現，基因靶向治療具有準確性高、副作用小等特點，已經成為腫瘤研究中的熱點[2]。中草藥提取物來源廣泛、不良反應較小，也是抗腫瘤中的研究重點，芒柄花黃素是從豆科植物紅色車軸草中提取的一種雌激素，有抗炎、降血壓等功效[3]。芒柄花黃素有抗腫瘤作用，其可以降低膀胱癌、卵巢癌等腫瘤細胞惡性生長能力[4-5]。miRNA在人體內有多種生物學作用，廣泛參與細胞生長、運動、代謝等過程[6]，還與腫瘤的關系密切，可能是腫瘤治療的分子靶點[7]。既往的研究表明，miR-4326在肺癌進展中發揮促進作用，下調其表達可以抑制肺癌細胞的侵襲和遷移能力[8]。現階段對于miR-4326和芒柄花黃素在肝癌進展中的作用尚不明確，本實驗探討下調miR-4326聯合芒柄花黃素干預對肝癌細胞生長、侵襲和遷移的影響和機制，為提高肝癌患者生存時間的用藥提供實驗基礎。

1 材料

1.1 細胞 肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3購自上海賽默飛生物科技有限公司；正常肝細胞HL7702購自北京晶萊華科生物技術有限公司。

1.2 試劑與藥物 芒柄花黃素對照品(純度>98%，批號MB1978)購自大連美侖生物技術有限公司。E-cadherin抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；β-catenin抗體、c-Myc抗體購自美國Santa Cruz公司；miR-4326抑制物、抑制物陰性對照購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Vimentin抗體購自上海研晶生物技術有限公司；miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。

2 方法

2.1 RT-qPCR檢測肝癌細胞中miR-4326表達 用Trizol試劑提取肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3和正常肝細胞HL7702中總RNA，紫外分光光度計測定A260/A280在1.8～2.0之間。根據miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，逆轉錄反應體系為0.5 μL Quant RTase、2 μL RT primer、1 μL Super pure dNTPs、2 μL Poly(A)反應溶液、1 μL RNasin、2 μL RT Buffer，用RNase-free ddH2O補充至總體積為20 μL，充分混合以后，于37 ℃孵育結合60 min，將合成的cDNA置于-20 ℃條件下保存。取cDNA，放在冰上配制PCR反應體系，1 μL cDNA、10 μL miRcure miRNA premix、0.4 μL 正向引物、0.4 μL反向引物，用RNase-free ddH2O補充至總體積為20 μL，94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。以2-△△CT法計算miR-4326表達，內參為U6。引物序列為miR-4326正向5′-GCCCGCTGTTCCTCTGTCTCCC-3′，反向5′-GTGCAGGGTCC GAGGT-3′。

2.2 MTT法檢測細胞增殖 將HCCLM3細胞密度調整為4×105/mL，吸取100 μL細胞懸液接種到96孔板，在細胞中加入含濃度為0、15、30、60、120 μmol/L芒柄花黃素的細胞培養液，將培養板置于37 ℃培養箱內繼續培養24 h，加入10 μL MTT溶液，置于37 ℃環境中反應4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，反應10 min，采用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值(A)，以A值表示細胞增殖能力。

2.3 細胞分組及處理 HCCLM3細胞分成對照組(不作處理)、anti-miR-NC組(轉染抑制物陰性對照)、anti-miR-4326組(轉染miR-4326抑制物)、anti-miR-NC+芒柄花黃素組(轉染抑制物陰性對照+30 μmol/L芒柄花黃素)、anti-miR-4326+芒柄花黃素組(轉染miR-4326抑制物+30 μmol/L芒柄花黃素)。對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組細胞培養24 h后，RT-qPCR法檢測miR-4326表達；對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組、anti-miR-4326+芒柄花黃素組細胞培養24 h后，MTT法檢測細胞增殖。轉染試劑為 Lipofectamine 2000，按照轉染試劑操作說明進行轉染。

2.4 Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移 各組細胞分別懸浮在不含胎牛血清的細胞培養液內，細胞密度為1×105/mL。侵襲實驗前在Transwell小室內加入Matrigel將小室濕化2 h，接著取200 μL上述細胞懸液至Transwell小室的上室，同時在下室內加入500 μL含胎牛血清的細胞培養液，放在培養箱內繼續培養24 h后，取出小室，用棉簽將沒有穿膜的細胞擦掉，多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下觀察細胞穿膜數目，隨機選擇6個視野，計數分析。

2.5 Western blot檢測細胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-Myc蛋白表達 收集培養24 h的各組細胞，預冷的PBS溶液重復洗滌細胞2次，加入細胞裂解液，置于冰上裂解30 min，12 000×g離心20 min，吸取上清，即為總蛋白，蛋白定量后和上樣緩沖液均勻混合，煮沸5 min進行變性，于-80 ℃保存。常規方法分別制備10%分離膠、5%濃縮膠，吸取蛋白樣品加入到上樣孔內，每孔30 μg蛋白樣品，設置電壓80 V、100 V，半干式方法進行轉膜，設置2.5 mA/cm2恒定電流冰浴轉膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h，置于一抗溶液(E-cadherin、Vimentin、c-Myc均以1∶1 000稀釋)中結合反應2 h，然后放在二抗溶液(1∶4 000稀釋)中結合反應2 h，ECL顯色試劑盒顯色，用Image J軟件分析條帶A值，GAPDH為內參蛋白，計算目蛋白的相對表達。

2.6 Wnt/β-catenin信號通路激活劑對HCCLM3細胞增殖、遷移、侵襲影響 取轉染miR-4326抑制物后的HCCLM3細胞，用含有30 μmol/L芒柄花黃素和30 mmol/L Wnt/β-catenin信號通路激活劑LiCl的細胞培養液培養，命名為anti-miR-4326+芒柄花黃素+LiCl組。以anti-miR-4326+芒柄花黃素組為參照，MTT檢測細胞增殖，Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移，Western blot檢測E-cadherin、Vimentin、β-catenin、c-Myc蛋白表達。

3 結果

3.1miR-4326在肝癌細胞中表達上調 如表1所示，肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3中miR-4326表達高于正常肝細胞HL7702(P<0.05)。本研究選擇miR-4326相對表達最高的肝癌細胞HCCLM3進行后續實驗。

表1 miR-4326在肝癌細胞HuH-7、SNU-449、HCCLM3和正常肝細胞HL7702中的表達

3.2 芒柄花黃素對HCCLM3細胞增殖的影響 如表2所示，與對照組(0 μmol/L芒柄花黃素)比較，芒柄花黃素干預后，HCCLM3細胞增殖活性降低(P<0.05)，30 μmol/L芒柄花黃素干預后，肝癌細胞存活率接近50%，選用30 μmol/L芒柄花黃素進行后續實驗。

表2 芒柄花黃素處理后HCCLM3細胞增殖活性比較

3.3 miR-4326抑制物對HCCLM3細胞中miR-4326表達的影響 如表3所示，與anti-miR-NC組比較，轉染miR-4326抑制物后，HCCLM3細胞中miR-4326表達降低(P<0.05)。提示，miR-4326抑制物能下調HCCLM3細胞中miR-4326表達。

表3 miR-4326抑制物轉染后HCCLM3細胞中miR-4326表達比較

3.4 芒柄花黃素聯合下調miR-4326對HCCLM3細胞增殖、侵襲和遷移的影響 如圖1、表4所示，與anti-miR-NC組比較，下調miR-4326或芒柄花黃素處理后，HCCLM3細胞增殖活性、侵襲數目、遷移數目均降低(P<0.05)，細胞中E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)；與anti-miR-4326組或anti-miR-NC+芒柄花黃素組比較，芒柄花黃素聯合下調miR-4326能夠協同降低肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力(P<0.05)，提高細胞中E-cadherin蛋白表達(P<0.05)，降低細胞中Vimentin蛋白表達(P<0.05)。

注：a～e分別為對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組。圖1 各組HCCLM3細胞侵襲、遷移能力(A)和E-cadherin、Vimentin蛋白表達(B)

表4 芒柄花黃素聯合下調miR-4326對HCCLM3細胞的影響

3.5 芒柄花黃素聯合下調miR-4326對HCCLM3細胞Wnt/β-catenin信號通路激活的影響 如圖2、表5所示，與anti-miR-NC組比較，下調miR-4326或芒柄花黃素干預后，HCCLM3細胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達降低(P<0.05)；與anti-miR-4326組或anti-miR-NC+芒柄花黃素組比較，芒柄花黃素聯合下調miR-4326能夠協同降低HCCLM3細胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達(P<0.05)。提示，芒柄花黃素聯合下調miR-4326能抑制HCCLM3細胞中Wnt/β-catenin信號通路的激活。

注：a～e分別為對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-4326組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組、anti-miR-NC+芒柄花黃素組。圖2 各組HCCLM3細胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達

表5 芒柄花黃素聯合下調miR-4326對HCCLM3細胞β-catenin、c-Myc蛋白表達的影響

3.6 Wnt/β-catenin信號通路激活劑對HCCLM3細胞增殖、侵襲、遷移及相關蛋白的影響 如圖3、表6所示，與未經LiCl處理的細胞比較，LiCl處理提高了芒柄花黃素聯合下調miR-4326處理的HCCLM3細胞增殖、侵襲和遷移能力(P<0.05)，提高了細胞中β-catenin、c-Myc、Vimentin蛋白表達(P<0.05)，降低了細胞中E-cadherin蛋白表達(P<0.05)。

表6 Wnt/β-catenin信號通路激活劑對HCCLM3細胞的影響

注：a為anti-miR-4326+芒柄花黃素組，b為anti-miR-4326+芒柄花黃素+LiCl組。圖3 各組HCCLM3細胞侵襲、遷移(A)和Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達(B)

4 討論

芒柄花黃素又名刺芒柄花素，是我國傳統中藥黃芪的主要活性成分之一，有調節免疫、改善炎癥等作用[9]，還具有抗腫瘤作用，可以抑制宮頸癌、結直腸癌、胃癌等腫瘤細胞的惡性生長和轉移[10-12]。本實驗結果顯示，芒柄花黃素處理后，HCCLM3肝癌細胞增殖能力降低，細胞侵襲和遷移能力降低，提示芒柄花黃素抑制HCCLM3細胞生長、侵襲和遷移。

miRNA是一類沒有編碼能力的小分子RNA，在自然界的真核生物體內存在，參與調控細胞分化、胚胎發育、能量代謝等過程。miRNA與人類多種疾病有關，參與疾病的病理進展，可能是疾病治療的靶向調節分子[13]。miR-4326是近些年來發現的與腫瘤有關的miRNA，在肺癌、多發性骨髓瘤等腫瘤中表達上調，并且下調miR-4326表達可以抑制腫瘤細胞的生長、遷移、侵襲[8,14]。本實驗結果表明，miR-4326在肝癌細胞中的表達高于正常肝細胞，下調miR-4326可以降低肝癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，提示miR-4326在肝癌進展中可能扮演類似癌基因的作用，靶向抑制miR-4326可能是肝癌治療的有效途徑。

腫瘤的轉移是一個復雜的過程，不僅與腫瘤細胞的侵襲、遷移能力等有關，還與腫瘤細胞EMT有關[15]。研究表明，發生EMT的腫瘤細胞的侵襲、遷移能力明顯增加，EMT被認為是腫瘤轉移的早期標志[16]。Vimentin是間質細胞標志蛋白，E-cadherin是上皮細胞標志蛋白，二者的表達是EMT水平的標志[17]。本實驗結果顯示，下調miR-4326和芒柄花黃素均可降低HCCLM3細胞中Vimentin表達，提高E-cadherin表達，并且二者聯合作用效果更好，提示芒柄花黃素聯合下調miR-4326抑制HCCLM3細胞增殖和轉移潛能。

Wnt/β-catenin是經典Wnt信號通路，在人體組織中廣泛表達，參與多種病理和生理過程[18]。Wnt/β-catenin影響細胞生長、代謝等過程，與動脈粥樣硬化、關節炎等疾病有關[19-20]。Wnt/β-catenin在腫瘤進展中過度激活，其活化后誘導腫瘤轉移和生長，抑制其激活具有抵抗腫瘤細胞增殖、遷移的作用[21]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白，c-Myc是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶點[22]。以往研究發現，芒柄花黃素調控腫瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路[23]。本實驗結果顯示，芒柄花黃素和下調miR-4326后，HCCLM3細胞中β-catenin、c-Myc蛋白表達均降低，并且激活Wnt/β-catenin通路可以逆轉芒柄花黃素聯合下調miR-4326對HCCLM3細胞的抑制作用，這提示芒柄花黃素聯合下調miR-4326通過Wnt/β-catenin影響HCCLM3細胞生長、侵襲和遷移。

綜上所述，芒柄花黃素聯合下調miR-4326可能是肝癌治療的途徑之一，可以抑制HCCLM3細胞的增殖、侵襲、遷移和EMT，其機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。這為臨床上提高肝癌患者生活質量提供了參考，為研究芒柄花黃素和下調miR-4326抗腫瘤機制提供了實驗基礎。