合成納米銀活性黃芪內生真菌篩選及其抑菌作用研究

張弘弛， 趙翊婷， 廉佳佩， 李 慧， 周 鳳， 劉 瑞*

(1.山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009；2.云南大學生命科學學院，云南 昆明 650091)

納米銀具有廣譜的抗菌和殺菌活性，由納米銀釋放出的Ag+具有抗微生物活性[1]。研究發現，納米銀對多種細菌及病毒有抑制作用[2]，因優秀的抑菌活性，其在化妝品、紡織品、食品儲藏保鮮、膳食補充劑、食品和醫藥包裝等領域得到廣泛的應用[2-4]。除了傳統的物理和化學合成納米材料的方法，近年來，利用真菌胞外生物合成納米銀被廣泛關注，此工藝有利于對合成條件的優化，具有使用常規設備、成本低，后期不需要破碎真菌細胞等優點，表現出工業化的潛力[5-6]。

植物內生真菌幾乎在所有植物中都能分離得到[7]，因其與宿主植物的長期共生關系，具有更加復雜的酶體系，成為了一類特殊的納米銀合成載體。已有的內生真菌合成納米銀研究發現，其合成的納米銀粒徑、大小、形狀更具有優勢，如薛柏吉[8]通過粉節皮菌和秘魯小帚梗柱孢霉合成金屬納米銀材料；黃檗通過黑附球菌合成金屬納米銀材料[9]；曲明星等[10]利用木霉屬真菌輔助合成納米銀。毛迪等[11]利用黃芪提取物生物還原制備納米銀，但利用黃芪內生真菌生物合成納米銀的研究未有報道。基于此，本研究篩選出能夠產生納米銀的黃芪內生真菌，為內生真菌合成金屬納米粒子提供了技術支持，同時對納米銀的合成條件進行優化，以期為進一步研究奠定基礎。

1 材料

1.1 菌株和培養基

1.1.1 內生真菌 課題組前期從恒山黃芪根部分離而來38株內生真菌[12-13]，保存于山西大同大學應用生物技術研究所，批號Am-R01～Am-R38。活化采用察氏固體培養基，發酵采用察氏液體培養基。

1.1.2 供試細菌 大腸桿菌(貨號CGMCC 1.12874)、銅綠假單胞菌(貨號CGMCC 1.9054)、金黃色葡萄球菌(貨號CGMCC 1.6750)、枯草芽孢桿菌(貨號CGMCC 1.9086)均由山西大同大學應用生物技術研究所提供。活化采用牛肉膏蛋白胨固體培養基，培養采用牛肉膏蛋白胨液體培養基，抑菌作用測定采用LB液體培養基。

1.2 試劑 硝酸銀、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、牛肉膏、蛋白胨均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器 SW-CJ-2F型超凈工作臺(金壇市盛威實驗儀器廠)；GW-D-100B型振蕩培養箱(北京市六一儀器廠)；UV-3200S型紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；HS 902720型電泳儀(美國Thermo公司)；HEAL FORCE型PCR儀(日本島津公司)；ABI 3730XL型測序儀(日本尼康公司)；MASTERSIZER 3000E型粒度分析儀(德國賀利氏公司)；HT7700型透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1 菌株篩選

2.1.1 內生真菌活化及1次發酵 將38株黃芪內生真菌菌株轉接于平板上，在28 ℃下培養7 d，無菌狀態下取出活化的內生真菌菌餅，按4餅/100 mL培養液的密度接種于滅菌的含100 mL察氏培養基的250 mL錐形瓶中，振蕩搖床培養，設置發酵條件為轉速130 r/min，溫度28 ℃，時間10 d。

2.1.2 內生真菌2次發酵 1次發酵結束后無菌過濾，菌絲體用無菌水洗滌2～3次，按接種量4 g/100 mL接種于含100 mL無菌去離子水的250 mL錐形瓶中，振蕩搖床培養，設置發酵條件為轉速130 r/min，溫度28 ℃，發酵24 h，結束后無菌過濾，即得發酵液。

2.1.3 合成納米粒子篩選 稱取0.17 g AgNO3固體，無菌水定容至1 000 mL，得到1 mmol/L AgNO3溶液，置于棕色試劑瓶中，在4 ℃下保存，將2次發酵液與1 mmol/L AgNO3按9∶1比例混合，在28 ℃下振蕩培養24 h。以未加AgNO3的真菌發酵液作為空白對照，目測反應液顏色變化，以顏色發生明顯反差變化的反應液為初步判斷該內生真菌具有合成金屬納米粒子的標志，鑒于發酵過程中生物反應量濃度較低，為了增加篩選確定性，將反應液濃縮5倍后以納米銀粒子的特殊吸收波長范圍(400～460 nm，特定波長420 nm)為檢測依據[14]，全波長掃描范圍300～600 nm，間隔1 nm，觀察38株內生真菌的反應液是否在此范圍內出現吸收峰。參考文獻[14]報道，精確篩選出具有合成金屬納米粒子活性的內生真菌以及活性強弱。

2.1.4 具有納米粒子合成活性菌株的粒度分析 取具有合成金屬納米粒子生物活性菌株的2次發酵液適量，采用粒度分析儀檢測納米銀粒徑，并進行粒度分析。

2.2 具有金屬納米粒子合成活性內生真菌的分子鑒定 高活性內生真菌Am-R02經平板培養后，無菌提取真菌菌塊，經真空干燥后制備干燥的菌絲，在液氮條件下將菌絲組織塊研磨至100目粉狀，采用CTAB法來提取內生真菌DNA，并檢測DNA純度和濃度，經PCR反應后，送三聯兄弟生物醫藥研究(北京)有限公司測序，獲得ITS序列在GenBank，Blast進行比對分析，選擇相似率最高的真菌ITS序列，用MEGA軟件Clustal X方法進行系統發育分析，采用Neighbor-Joining法，Boottrap值設置1 000構建系統發育樹對內生真菌鑒定[15]。

2.3 內生真菌Am-R02生物合成納米銀條件優化

2.3.1 單因素試驗 對反應時間(1、2、4、6、8、10、12、24 h)、AgNO3濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)、反應溫度(24、26、28、30、32 ℃)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)進行考察。

2.3.2 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，以AgNO3濃度(A)、反應溫度(B)、pH值(C)為影響因素，吸光度為評價指標，采用Design-Expert V 8.05軟件進行響應面試驗，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4 透射電鏡分析 在馬弗爐中灼燒納米銀后，研磨再溶解于乙醇，超聲清洗器分散5 min，取10 μL制備液滴在碳支持膜銅網，靜置5 min，去除多余液體，滴加2%磷鎢酸于碳支持膜銅網靜置2 min，去除多余液體，室溫干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.5 抑菌試驗

2.5.1 納米銀制備 按“2.1.2”項下方法制備Am-R02二次發酵液共3 L，按“2.3”項下優化條件制備納米銀，收集反應液，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀，進行冷凍干燥，即得。取適量在無菌條件下超聲分散于去離子水中，得到1.0 mg/mL溶液。

2.5.2 抑菌作用測定 采用二倍梯度稀釋法[16]測定。取1.0 mg/mL納米銀溶液100 μL至96孔細胞培養板中，用LB液體培養基以二倍梯度稀釋法依次稀釋至0.03～500 μg/mL。將2.0×107CFU/mL細菌懸液以100 μL/孔密度接種至96孔細胞培養板中，設培養基對照孔、菌液對照孔、陽性對照孔(氨芐西林、四環素)，微孔板加蓋，保鮮膜密封以減少孵育過程中的水分蒸發，置于37 ℃培養箱中培養12 h后，在630 nm波長處測定吸光度，確定最小抑菌濃度(MIC)。

3 結果

3.1 活性菌株篩選 根據反應液顏色變化(圖1)和全波長掃描測定結果，篩選得到具有合成納米銀活性的黃芪內生真菌有4株，分別為Am-R02、Am-R11、Am-R16、Am-R24，見表2。在400～460 nm波長處，Am-R02、Am-R11、Am-R16、Am-R24均有最大吸收峰，在420 nm處的光密度分別為1.532 1、0.436 2、0.747 9、0.423 3，表明Am-R02合成納米銀能力最強，其次為Am-R16、Am-R11，Am-R24最弱。

注：左邊二次發酵液無金屬離子，右邊二次發酵液添加了金屬離子。圖1 活性菌株Am-R02顏色

3.2 粒度分析 Am-R02產生的納米銀粒徑分布較均勻，以0～5 nm為主，占總數的1/3，5～10、10～15、15～20 nm的粒徑均占15%；Am-R11產生的納米銀粒徑大多在25 nm以下，以0～5 nm為主，占總數50%以上，而5～10 nm占1/3，10～25 nm在10%以內；Am-R16產生的納米銀粒徑大多在30 nm以下，以0～5 nm為主，占總數50%以上，

表2 活性菌株篩選結果

而5～10 nm占1/3，10～20 nm在20%以內；Am-R24產生的納米銀粒徑大多在30 nm以下，以0～5 nm為主，占總數70%，而5～10 nm占10%，10～25 nm占20%，見圖2。

圖2 納米銀粒徑分布

3.3 Am-R02測序和進化樹分析 Am-R02的ITS序列長度為556 bp，BLAST比對結果表明，其rDNA-ITS序列與Aspergillusparvisclerotigenus的相應序列的同源性為100%。系統進化樹(圖3)顯示，該菌株與Aspergillusparvisclerotigenus聚在一支，支持率為100。最終，將Am-R02鑒定為Aspergillusparvisclerotigenus。

圖3 Am-R02系統發育分析

3.4 合成條件優化

3.4.1 反應時間 由圖4可知，反應10 min時開始有納米銀合成，隨著時間延長逐漸增多，在12 h時吸光度最高，但之后逐漸降低，可能是因為納米銀開始大量分解，故選擇12 h作為反應時間。另外，超過12 h后納米銀積累值趨于飽和，故響應面試驗不再將反應時間作為影響因素。

圖4 反應時間對合成納米銀的影響

3.4.2 AgNO3濃度 由圖5可知，不同濃度AgNO3溶液與發酵液反應時，吸光度呈明顯差異，在2 mmol/L時最高，故選擇2 mmol/L左右作為AgNO3濃度。

圖5 AgNO3濃度對合成納米銀的影響

3.4.3 反應溫度 由圖6可知，隨著反應溫度增加，納米銀合成速率加快，在28 ℃時吸光度最高，故選擇28 ℃左右作為反應溫度。

3.4.4 pH 由圖7可知，在pH為8.0時吸光度最高，即納米銀合成效率最高，而在9.0時吸光度略有下降，5.0時最低，說明在酸性條件下抑制了納米銀合成，故選擇8.0左右作為pH。另外，pH對合成納米銀的影響程度大于反應時間、AgNO3濃度，其原因可能是pH影響了納米銀合成通路的酶活性，具體需要深入研究。

3.4.5 響應面試驗 以AgNO3濃度(A)，反應溫度(B)、pH(C)為影響因素，吸光度(Y)為評價指標，響應面試驗優化合成條件，結果見表3。

表3 試驗設計與結果

表4 方差分析

響應面分析顯示，隨著各因素增加或延長，吸光度隨之升高，但之后反而有降低趨勢，并且各因素之間交互作用不顯著，與方差分析結果一致。殘差圖分析顯示，模型呈正態分布，殘差擬合曲線為線性，預測值呈散點分布，表明擬合結果可靠。另外，預測值與實際值的擬合情況良好，實驗數據呈散點分布并位于直線兩側，同時誤差較小。

最終確定，最優條件為AgNO3濃度1.97 mmol/L，反應溫度27.67 ℃，pH 8.01，吸光度0.711，考慮到實驗操作的可行性，將其修正為AgNO3濃度2.0 mmol/L，反應溫度28 ℃，pH 8。

3.5 驗證試驗 按“3.4”項下優化條件進行3批驗證試驗，測得吸光度分別為0.681、0.702、0.715，平均值為0.699，RSD為2.45%，表明該條件穩定可靠。

3.6 形態表征 Am-R02胞內提取物合成的納米銀呈球形或近球形，大小形態均一，粒徑主要為1～20 nm，分散性較好，呈單一分散狀態，見圖8。

圖8 納米銀透射電鏡圖

3.7 抑菌作用實驗 由表5可知，納米銀對各細菌均有較強的抑制效果，介于氨芐西林和四環素之間。

4 討論

本研究從黃芪根的38株內生真菌篩選具有合成金屬納米粒子能力的內生真菌，獲得了4株能合成納米銀的菌株，其中合成活性最高的內生真菌Am-R02鑒定為Aspergillusparvisclerotigenus。對Am-R02合成納米銀的條件優化得到最佳條件為pH 8.0，AgNO3濃度2 mmol/L，反應時間12 h。在影響納米銀合成的條件中，pH值屬于顯著性因素，后續pH值的影響機制需要深入研究。

表5 抑菌作用實驗結果

Mohan等[17]研究發現，較低濃度的納米銀即能夠抑制銅綠假單胞菌和大腸桿菌的生長。Morones等[18]發現粒徑1～100 nm的納米銀對革蘭氏陰性菌有很好的殺菌作用，推測可能是納米銀緩釋銀離子，進而起到一定的殺菌效果。本研究發現，Am-R02合成的納米銀的粒徑主要分布在20 nm以下，抑菌作用實驗也證實了其在低濃度時就對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑制作用，本研究合成的納米銀表征形態以及其在低濃度的抗菌活性數據與張映[19]利用鉤狀木霉生物還原制備納米銀的性質類似，而抑菌性研究結果與以上學者利用其它植物內生真菌合成納米銀的研究結果有一定的差異性，說明真菌胞外生物合成納米銀的抑菌能力與真菌種屬類別有一定的關系。