CRISPR/Cas技術在乳酸菌中的研究進展

房思昌，宋馨，薛玉玲，王世杰,*

1(河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊,050018)2(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海,200093) 3(石家莊君樂寶乳業有限公司，河北 石家莊,050221)

1987年，日本研究者在對大腸桿菌iap基因測序時發現了一段異常結構，這一結構串聯間隔重復。重復基因由29個堿基構成，非重復基因由32個堿基構成，在其他原核生物中沒有發現與其同源的基因序列。由于當時受到科學技術的制約及人們認識的匱乏，沒有深入了解其生物學功能[1]。隨后，有學者研究發現間隔重復序列廣泛存在于原核生物基因組和古細菌中，將它們命名為成簇的規則間隔短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)，并且發現CRISPR是可移動的序列，在含有CRISPR的原核生物中還發現了比較保守的基因稱為Cas基因[2]。此外，在化膿鏈球菌(StreptococcuspyogenesSF370)中發現CRISPR序列的間隔區與其他菌株中的前噬菌體具有高度的同源性，且噬菌體不能入侵具有相同CRISPR序列間隔區的古細菌細胞，由此推測CRISPR序列可能對外源DNA具有特異性免疫功能。

隨著人們對原核生物基因組分析需求的增加，研究者進一步將基因組學應用到細菌中并闡明其生物學功能[3]。2007年，BARRANGOU團隊在對嗜熱鏈球菌基因組分析時首次證實了CRISPR系統能夠特異性抵御噬菌體的入侵[4]，2010年以后，CRISPR-Cas系統的功能逐漸明確：由向導RNA引導Cas蛋白酶靶向切割外源DNA的特異性免疫系統。CRAWLEY等[5]在對1 262種乳酸菌基因組分析時發現普遍存在CRISPR免疫功能，其中Ⅱ-A型系統在自身乳酸菌宿主中占主要活性，能夠有效對外源及宿主DNA進行編輯，SANOZKY-DAWES等[6]在對加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)CRISPR/Cas研究時發現存在一種Ⅱ-A型系統，其間隔區呈現多樣性，證實了該系統能夠應用在乳酸菌中，拉開了應用CRISPR進行乳酸菌功能解析的序幕。

1 CRISPR-Cas系統

CRISPR-Cas系統由一個CRISPR基因序列和相對保守的Cas基因組成，存在于大約83%的古細菌和45%的細菌中。CRISPR基因座由前導序列(leader)，重復序列(repeat)和間隔序列(spacer)構成。前導序列位于CRISPR基因座上游，長度為500～700 bp，是CRISPR轉錄的起始點，重復序列長度為28～37 bp，負責轉錄反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)形成發卡結構。間隔序列是從侵入的外源DNA中截取的一小段基因序列，相當于將入侵者拉入了“黑名單”，當攜帶有此間隔序列的外源DNA再次侵入時，CRSPR-Cas系統會進行精確的識別并清除[7]。Cas基因負責轉錄Cas蛋白，Cas蛋白包括Cas1～Cas10等多種蛋白，負責間隔序列的獲取和對外源DNA的防御，其中CRISPR/Cas9系統發展速度最快且在乳酸菌中應用最為廣泛[5]。

CRISPR-Cas9系統中Cas9蛋白、成熟的CRISPR RNA(crRNA)和tracrRNA、以及原間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)是最主要的4種元件，Cas9蛋白包括2個易于識別的核酸酶結構域HNH和RUVC，就像兩把剪刀將DNA的兩條單鏈進行剪切；crRNA是間隔序列的轉錄產物，它由RNA內切酶Ⅲ(RNaseⅢ)促進成熟并與tracrRNA一起形成單向導RNA(single guide RNA,sgRNA)，其作用為引導Cas9蛋白到正確的外源DNA切割位點[8]；當然，只靠sgRNA的引導作用是不夠的，還需要另一關鍵因素PAM序列作為特異性的識別位點，它是位于外源DNA上由NGG(N為任意堿基)3個堿基組成的小段序列，Cas9復合物與PAM近端結合，DNA雙鏈解開[9]。CRISPR-Cas9簡單免疫流程為：Cas1、Cas2等蛋白對入侵的外源DNA進行剪切并將其一段基因序列放入CRISPR序列中，再次入侵時CRISPR序列識別并轉錄產生Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA，2種RNA結合形成sgRNA與Cas9蛋白形成效應復合物并識別PAM序列近端雙鏈DNA使其解旋，Cas9核酸酶2個結構域分別切割形成雙鏈斷裂(double strand break，DSB)(圖1)。隨后出現了Cas9的突變體nickase Cas9(nCas9)與dead Cas9(dCas9)，nCas9又名Cas9切口酶，它與Cas9蛋白的差異在于失活了HNH(Cas9D10A)或RUVC(Cas91840A)結構域，在被單向導RNA引導到靶向位置后單一的結構域能夠在靶基因單鏈形成一個小的缺口而不是DSB，更易實現斷

圖1 CRISPR-Cas9基因座及免疫流程Fig.1 CRISPR-Cas9 locus and immune process

裂基因的修復，目前已在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)中得到了很好的應用[10]。dCas9中2個核酸酶結構域都失活使其失去雙鏈切割的能力，但依然能夠與雙鏈結合，阻礙了RNA聚合酶與靶基因的結合，成為實現基因沉默的重要工具，并在植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)中得到良好的應用[11-12]。

2 CRISPR-Cas系統分類

CRISPR系統按基因座和Cas蛋白可以分為兩大類(表1)；一類包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，二類包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型，每種類型因作用位點不同又分為多種亞型，包含標志性蛋白來進行靶基因的切割，不同的是二類系統使用單一的多結構域蛋白發揮作用，而一類系統使用大型的多亞基復合體來進行切割，這種大亞基蛋白由CRISPR基因座上的Cas7蛋白形成螺旋骨架連接Cas5并與crRNA緊密結合，Cas8或Cas10及其他亞基與Cas5連接。一類系統通常由Cas6或Cas5負責促使crRNA成熟，二類系統中Ⅱ型系統crRNA的成熟靠RNaseⅢ，Ⅴ、Ⅵ型大部分crRNA成熟分別靠Cas12、Cas13效應蛋白的部分核酸酶活性物質催化。切割過程中Ⅰ型Cas8負責PAM的定位并由Cas3解旋酶切割，Ⅲ型系統通過效應復合物中Cas10的CARF結構域靶向入侵的DNA和RNA，Ⅳ型屬于Ⅰ型與Ⅲ型的衍生物，因缺乏必要的Cas蛋白其潛在的功能還不明確。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型主要通過Cas9、Cas12a、Cas13及相關結構域HNH、Ruvc、HEPN進行剪切[13-14]。在174種乳酸菌的基因組分析中，58個基因組中發現了CRISPR序列，其中Ⅱ型系統在鏈球菌和乳桿菌中較為豐富、在副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)中發現了Ⅰ型系統的存在，其次是Ⅲ型系統，109個基因組中未檢測到CRISPR序列，其他類型如Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統在基因組中沒有檢測到[15]。

受乳酸菌物種差異的影響，可以將其分為內源性與外源性CRISPR系統，內源性系統指自身存在的完整系統，在嗜熱鏈球菌中較為常見，但因基因組中缺乏非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)而不能得到很好的利用，HIDALGO-CANTABRANA等[21]分析了卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)中內源性Ⅰ型系統的作用機制，并成功實現了p-gtf(胞外多糖引導糖基轉移酶基因)的敲除，為重新利用內源性系統提供了依據。利用外源性的CRISPR系統是目前有效的方法，可以在一些缺乏完整的CRISPR系統如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、巴氏乳桿菌(Lactobacilluspasteurii)或含有內源性系統的乳酸菌中得到利用，GOH等[22]在利用外源性nCas9系統pLCNICK嗜酸乳桿菌進行了基因的敲除和插入，同時證實可以在加氏乳桿菌和副干酪乳桿菌中得以利用。

表1 CRISPR-Cas系統分類及作用機制Table 1 Classification and action mechanism of CRISPR CAS system

3 CRISPR-Cas9在乳酸菌中的應用

3.1 基因編輯工具

3.1.1 傳統基因編輯工具

目前已經開發了多種乳酸菌基因編輯技術：基于質粒的同源重組交換技術、線性DNA重組技術和基于質粒的CRISPR基因編輯技術。

基于質粒的同源重組有單交換和雙交換2種方法，單交換方法指質粒與目的基因兩側的同源序列一次交換實現基因的敲除與插入，LELOUP等[23]利用pRV300敲除質粒在清酒乳桿菌(Lactobacillussake)上通過同源重組單交換置換掉pstⅠ基因及lacL基因，闡釋了2種基因生物學存在的意義。但這種方法重組效率低，容易引進抗性基因，增加后期篩菌的難度，雙交換的方法利用二次同源交換解決了抗性基因遺留的問題，GROOT等[24]利用雙交換法在植物乳桿菌WCFS1分析了與Mn2+穩態之間的關系。應用2次同源交換剔除單交換插入的目的基因，但這種編輯方法操作繁瑣且耗時，成本高。

線性DNA重組技術與基于質粒的同源重組技術原理相同，包含單鏈DNA重組和雙鏈DNA重組，都是利用同源序列進行基因組的同源交換，不同的是線性DNA重組技術不需要構建質粒，只需在外源重組酶及類似物的輔助線性化為單鏈DNA完成與目的基因的交換，因此不會引入除目標基因以外的其他基因，例如抗性基因，但此項技術在乳酸菌中并沒有廣泛展開，原因是乳酸菌缺乏輔助該技術的外源重組酶及類似物[25]。

3.1.2 基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術

基于CRISPR的編輯技術已經成為乳酸菌基因組編輯的強力工具，CRISPR-Cas9的簡便操作性使其成為分子生物領域中的熱點。目前已經開發了基于Cas9和Cas9變體的編輯技術以及與傳統基因編輯工具聯用的技術。

CRISPR-Cas9輔助的線性DNA重組技術在線性重組的基礎上利用了Cas9剪切致死性效果，提高了后期對野生型菌株的篩選效率。OH等[26]首次在乳酸桿菌中實現了基于CRISPR編輯的第一個示例CRISPR-Cas9選擇與單鏈DNA(ssDNA)重組相結合并成功在羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)ATCC6475中進行了編輯。通過SpyCas9靶向野生型序列清除未編輯的細胞，成功地編輯了基因組中的3個不同位點，篩選出克隆的效率高達100%。GUO等[27]首次在乳酸乳球菌NZ900中利用高效外源重組酶Rect優化了ssDNA重組，并結合Cas9反選擇消除未突變野生型菌株，在72 h內效率達到75%以上。ZHOU等[28]在植物乳桿菌WCSF1中利用Cas9線性DNA重組技術在無抗情況下通過核糖體替換和啟動子的點突變增強了前體途徑，實現了n-乙酰氨基葡糖的產生。

HUANG等[29]通過RecE/T輔助修復的Cas9工具，在雙質粒系統中實現植物乳桿菌WCSF1和短乳桿菌ATCC 367單基因敲除，敲除效率為50%～100%，高效修復雙鏈斷裂。SONG等[10]在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)中失活Cas9的D10A結構域形成單鏈缺口的Cas9D10A系統，有效繞過DSB的致死性，與前者相比，后者更有效刺激同源重組修復。SONG等[30]以pLL質粒為基礎在乳酸乳球菌NZ9000中開發了單質粒CRISPR系統，經過啟動子的篩選和單向導sgRNA的替換后對ldh基因進行了有效的敲除，敲除效率達50%。此外，將Cas9結構域同時失活構成的dCas9系統，其中的dCas9蛋白與目標基因結合后失去靶向裂解基因的能力，成為實現基因沉默和轉錄調控的強大工具。XIONG等[11]在乳酸乳球菌NZ9000中開發了基因轉錄抑制的雙質粒系統，使用誘導型啟動子Pnisin驅動鏈球菌中dCas9的表達，而強的組成型啟動子P44驅動引導RNA表達單個或多個基因，效率高達99%，成為基因沉默的重要工具。目前已成功應用到大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌和乳酸乳球菌中。一系列Cas9變體的出現成為創造乳酸菌Cas9工具箱新路徑。CRISPR-Cas基因編輯技術如表2所示。

表2 CRISPR介導的操作技術Table 2 CRISPR mediated operational techniques

3.2 CRISPR-Cas9技術的應用

3.2.1 功能基因解析

基因編輯是利用一定的手段對目的基因進行刪除、插入和替換的操作技術。由于Ⅱ型CRISPR-Cas9系統在乳酸菌中占據多數，最常用的來源于化膿鏈球菌CRISPR-Cas9(spyCas9)系統已應用到干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊式乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌中。LEMAY等[33]利用SpyCas9在乳酸乳球菌MG1363中研究噬菌體侵入與細菌蛋白質組成的關系，通過敲除llmg_0219基因產生了對p2噬菌體的抗性，揭示了乳酸菌抗性的原因。WANG等[34]利用Spycas9基因編輯系統構建了植物乳桿菌AR113單、雙、三重bsh(膽鹽水解酶基因)敲除突變體，通過對4種bsh基因的敲除，利用不同種類的膽汁酸鹽評價bsh突變后的菌株耐膽鹽活性，得出bsh1與bsh3對膽鹽耐受性至關重要，甘氨酸結合的膽鹽是bsh的首選底物，為膽汁酸耐受性高的菌株的合理高通量篩選提供了依據。MYRBR?TEN等[12]利用SpyCas9在植物乳桿菌WCSF1中通過雙質粒dCas9系統探索了細菌生長過程中Acm2、DnaA和EzrA(細胞周期基因)相關蛋白的表達含量，通過抑制3種基因的細胞分離蛋白的表達得出DnaA、EzrA與細胞的生長周期有著密切的聯系。TIAN等[35]利用SpyCas9系統以副干酪乳桿菌NCBIO01-M2ldh(乳酸脫氫酶基因)為靶標對其進行敲除和過表達，篩選出在45 ℃下產量達221 g/L、光學與化學強度達99%的L-乳酸菌株(表3)。

3.2.2 CRISPR基因座利用

CRISPR間隔物反映了菌株的演變軌跡，當菌株被外源噬菌體侵入時，新的間隔物會按時間順序整合到CRISPR序列的前導區，由于CRISPR-Cas在許多乳酸菌中占據較高的發生率，在菌株分型和CRISPR分類方面提供了一定的數量優勢。PUJATO等[37]在49株乳桿菌中分析了其間隔子含量、CRISPR序列及Cas蛋白的分布，通過PCR篩選后發現29株菌中含有完整的CRISPR系統，Ⅱ型豐富度最高，僅在副干酪乳桿菌85中發現Ⅰ型CRISPR系統且該系統較為活躍。ROGALSKI等[38]利用CRISPR間隔序列長度成功在發酵面團中分離出11種舊金山乳桿菌(Lacto-

表3 CRISPR介導的基因編輯Table 3 CRISPR mediated gene editing

bacillussanfranciscensis)菌株。SCALTRITI等[39]分析了25株瑞士乳桿菌CRISPR序列差異性，所有菌株均屬Ⅰ型系統且發現一個新的crispr重復家族lhel3。應用這種方法為預測CRISPR的潛在功能以及演化方向提供了一定的見解(表4)。

表4 利用CRISPR序列分析Table 4 Interspecific classification using CRISPR system

4 展望

CRISPR-Cas系統作為一種強大的基因編輯技術，已廣泛用于基因編輯、堿基編輯、轉錄調控、熒光成像等領域，為各個行業提供了一種新型生物技術工具，從最初的CRISPR免疫系統到基因編輯系統的開發及不斷完善，但在乳酸菌基因編輯方面還不夠成熟，雖然二型CRISPR系統在乳酸菌中得到廣泛應用，但其存在一定的局限性，不同乳酸菌外源性Cas9質粒轉化條件不同，需要進行轉化條件的優化為接下來的操作打下基礎。Cas9質粒轉化后Cas9蛋白有時并不能與靶標基因進行精準的結合，導致其產生脫靶效應。STOUT等[41]將干擾質粒導入加氏乳桿菌篩選出靶向逃逸的Cas9，并在此基礎上發現間隔子的缺失是Cas9靶向逃逸的原因之一。Cas9靶向雙鏈斷裂時乳酸菌自身缺陷所帶來的基因毒性等副作用和sgRNA的表達量不足影響后續的基因組編輯，同時因其在乳酸菌中不同物種之間對雙鍵斷裂的致死率差異較大，對基因組應用的范圍得不到擴展，LEENAY等[42]證實了植物乳桿菌菌株之間基因編輯的差異性，在3種不同的植物乳桿菌菌株(WCFS1，WJL和NIZO2877)中，對SpyCas9編輯的2種不同方法進行了直接比較,發現在多個植物乳桿菌菌株中編輯同一位點并不總是成功。所以未來需要更多功能獨特的新型菌株來進行CRISPR系統開發。

當然，這些問題是可以解決的，目前已經有了有效的應對方案，利用電轉化的方式將質粒轉入乳酸菌中大大提高了轉化效率。針對Cas9系統的脫靶效應，研究者可改變Cas9蛋白的特性，使其靶向目的基因更加精準，或通過設計更加具備兼容性的PAM序列來提高Cas9靶向的效率，該策略已在人體細胞中得以成功應用，擴展了Cas系統的靶向范圍。通過Cas9切口酶大大降低了因雙鏈斷裂導致的致死性，通過利用不同強度的啟動子優化基因編輯工具，PCR獲得不同的啟動子片段，利用無縫克隆的方法，替換原有的啟動子提高了sgRNA的表達量。CRISPR-Cas9乳酸菌編輯技術已經成為研究人員的熱點，從此系統的發現到可以自由對基因的改造實現了巨大的飛躍，在外源性CRISPR方面將會開發更加廣譜且簡便的編輯工具，對內源性CRISPR菌株的挖掘為以后新型乳酸菌菌株的開辟提供了可能性。而且在不久的將來將會出現更多的亞型和Cas蛋白的突變體并應用到乳酸菌中。