不同谷子品種儲藏期間褪色特性分析

張晉麗，張乾翔，靳豐璐，馬 琦，任清銘，張 彬

（山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica（L.）Beauv）屬禾本科狗尾草屬，起源于我國黃河流域，是我國重要的雜糧作物，由野生狗尾草馴化得來，在我國已有好幾千年的馴化歷史[1]。谷子具有生育期短、抗旱、抗貧瘠、穩產等特點[2-4]，因此，受到廣大研究者的關注。如今，人們越來越重視小米的品質與儲藏穩定性問題。谷子營養成分均衡，與水稻和小麥相比，小米富含蛋白質、粗脂肪和礦物質[5-6]，可滿足我國人民的飲食需求[7]。

外觀品質是消費者選擇小米產品最直觀且首要的指標，而米色在其中占有重要的地位，優質小米色澤深黃且一致性好[8]。小米中色素含量與其外觀品質呈顯著正相關關系，小米米色主要由類胡蘿卜素組成，與類胡蘿卜素積累存在顯著正相關[9]。脂肪氧化酶（LOX）是一種非血紅素含鐵的脂肪酸雙加氧酶，是生物體中發現的一種催化多不飽和脂肪酸（花生四烯酸、亞油酸）過氧化的酶，廣泛存在于動植物中[10]。LOX 是類胡蘿卜素降解過程中的關鍵酶，過高的LOX 活性會加快脂質氧化，使籽粒氧化變質，從而縮短其儲藏期，導致糧食營養成分損失，商業價值下降。孫道杰等[11]研究結果表明，小麥LOX 活性會影響面粉中的黃色素含量；GAYEN等[12]研究發現，在黃金水稻中，r9-LOX1基因是導致水稻種子儲藏過程中類胡蘿卜素降解的主要因素。LEENHARDT 等[13]和孫海峰等[14]研究結果表明，LOX 與小麥面粉中的類胡蘿卜素偶聯氧化會使小麥粉變白，但是過高的LOX 活性則會嚴重破壞小麥籽粒中的黃色素，使面粉過白并失去了許多營養物質，造成麥類食品營養價值下降。LOX 的研究多見于水稻、大豆、小麥等作物，但是對于谷子LOX 的研究幾乎沒有涉及。從糧食耐儲藏的角度考慮，降低籽粒LOX 活性是長期保存種子經濟有效的方法，甚至可能比冷凍儲藏更有效[15-19]。因此，對小米籽粒中LOX 活性與耐儲藏關系進行研究，從遺傳育種的角度來看具有重要意義。有研究表明，面包制作過程中類胡蘿卜素損失和LOX 活性呈極顯著相關（R2=0.97），且與小麥基因型有關，可以通過利用具有高類胡蘿卜素含量和低LOX 活性的小麥品種來顯著提高面包中類胡蘿卜素水平[12]。山西農業大學雜糧分子育種團隊前期研究表明，SiLOX3、SiLOX4、SiLOX7這3 個基 因與小 米褪色關聯性最高，因此，對這3 個基因在4 個谷子品種籽粒不同灌漿時期進行了表達模式分析。

本研究以4 個不同黃度的谷子品種為試驗材料，通過對比4 種褪色快慢不同的谷子品種的米色、總類胡蘿卜素含量、脂肪氧化酶活性，以及SiLOX3、SiLOX4、SiLOX7基因在籽粒發育不同時期的表達量，探究小米脂肪氧化酶與儲藏期間褪色的關系，旨在為培育耐儲藏優質谷子品種提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以4 種不同黃度的名優谷子品種龍谷25 號（LG25）、晉谷21 號（JG21）、沁黃2 號（QH2）、豫谷1 號（YG1）為試驗材料，于2020 年種植于山西農業大學雜糧分子育種團隊試驗田。

1.2 試驗方法

選擇土壤肥力均勻一致的田地統一種植，完全隨機區組設計，小區面積為50 m2，每個品種3 次重復。待完全成熟后，將各品種谷子進行谷粒脫殼，統一置于室溫條件下避光保存，每2 個月測定1 次米色、類胡蘿卜素含量、小米脂肪氧化酶活性等指標。另外，在籽粒的不同灌漿時期，于灌漿中期S3（乳狀物質固化，胚處于粉狀物質中）、灌漿后期S4（籽粒質地硬化）、灌漿末期S5（籽粒完全成熟）分別取出籽粒，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱待用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 米色測定 使用色差儀對小米米色測定，每個品種測量3 次，取平均值。b*表示黃/藍度，正值代表黃色，負值代表藍色。將儲藏期間的米色變化值占儲藏初期的比例設為褪色率。

1.3.2 類胡蘿卜素提取與測定 采用AACC 法提取小米籽粒類胡蘿卜素含量[8]。使用SP-Max2300A光吸收型全波長酶標儀測定其在450 nm 處的吸光值A450，設置3 次重復，以水飽和正丁醇溶液為參比。

其中，A450為波長450 nm 處類胡蘿卜素的吸光值；V為提取液體積（mL）；m為樣品質量（g）；0.250為類胡蘿卜素轉換系數。

將儲藏期間的總類胡蘿卜素含量變化值占儲藏初期的總類胡蘿卜素含量的比例設為總類胡蘿卜素降解率。

1.3.3 小米脂肪氧化酶（LOX）活性的測定 小米脂肪氧化酶活性測定參照孫海峰等[14]的方法進行。

1.4 SiLOX 基因在不同米色谷子品種籽粒灌漿期的表達模式

利用qRT-PCR 方法驗證LOX基因在小米籽粒不同時期的表達模式。選取各品種S3—S5 的谷子，去殼后提取籽粒RNA，反轉錄為cDNA；利用Primer Premier 5.0 軟件設計定量引物，引物序列如表1所示。引物由上海生工公司合成。運用Bio-Rad CFX96TM Touch 實時熒光定量PCR 系統，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑，進行熒光定量PCR。試驗設置3 次生物學重復，每個生物學重復設置3 次技術重復。

表1 SiLOX 基因定量引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequence of SiLOX genes

2 結果與分析

2.1 不同谷子品種米色表型分析比較

由表2 可知，儲藏初期，小米米色由淺至深依次是YG1、JG21、QH2、LG25，其中，LG25 的b*值最大，為54.18，YG1 的b*值最小，為44.60。經過11 個月的儲藏，褪色較快的是YG1，褪色率為13.36%，褪色較慢的是JG21，褪色率為11.32%。通過對比分析不同谷子品種儲藏期間b*值的變化趨勢（圖1），發現從儲藏初期到儲藏5 個月，4 個谷子品種米色變化趨勢較為平緩，儲藏至7 個月時，LG25、QH2、YG1 這3 個品種b*值加速下降，JG21則稍有上升而后下降，YG1 的變化趨勢最為迅速，整個儲藏期間沒有上升的趨勢。

表2 儲藏期4 個谷子品種小米米色b＊值和總類胡蘿卜素含量變化Tab.2 The change of b* value and the total carotenoids contents of four varieties of foxtail millet during storage

圖1 儲藏期4 個谷子品種小米米色b*值和總類胡蘿卜素含量變化趨勢Fig.1 The change of b* value and the total carotenoids contents of four varieties of foxtail millet during storage

2.2 不同谷子品種總類胡蘿卜素含量變化分析

由圖1 可知，在儲藏初期，總類胡蘿卜素含量較高的是JG21，為24.52 mg/kg，總類胡蘿卜素含量較低的是YG1，僅有12.66 mg/kg。LG25、YG1的總類胡蘿卜素含量均呈現先緩慢上升后下降的趨勢。QH2 的總類胡蘿卜素含量則先下降隨后上升最后再下降，JG21 的總類胡蘿卜素含量在儲藏期間有2 次升高的階段。儲藏11 個月，YG1 表現出較快的下降趨勢，總類胡蘿卜素降解率為55.85%，JG21 降解較慢，降解率為32.63%（表2）。

2.3 小米儲藏期間脂肪氧化酶活性分析

儲藏期4 個谷子品種小米LOX 活性變化趨勢如圖2 所示。

圖2 儲藏期4 個谷子品種小米LOX 活性變化趨勢Fig.2 The change of LOX activities of four varieties of foxtail millet during storage

從圖2 可以看出，儲藏初期，小米LOX 活性較高的是YG1，活性為21.69 AU/（g·min），LOX 活性較低的是QH2，活性為16.38 AU/（g·min）；儲藏5個月 時LG25、QH2 和JG21 的LOX 活性達 到最高，而YG1 的LOX 活性則在儲藏7 個月后達到最高（45.02 AU/（g·min）），推測這是造成YG1 褪色最快、類胡蘿卜素降解最快的原因之一。而JG21 在整個儲藏期間LOX活性變化平緩，這個趨勢與b*值和總類胡蘿卜素含量變化保持一致。4 個谷子品種在儲藏期間LOX 活性的變化趨勢整體呈現先升高后降低的趨勢。

2.4 SiLOX 基因在谷子籽粒不同灌漿時期表達模式分析

從圖3 可以看出，SiLOX3基 因在S3—S5 時期在YG1 中的表達量顯著高于其他3 個品種，且在JG21 中的表達量沒有明顯變化。SiLOX4基因在QH2 和JG21 中的表達量相對穩定，在S4 時期，LG25 的基因表達量顯著高于其他品種，到S5 時期，SiLOX4基因在YG1 中的表達量達到最大。在S3 時期，SiLOX7基因在YG1 和JG21 中的表達量偏高；在S4 時期，SiLOX7基因在LG25 和JG21 中的表達量高于YG1 和QH2；到S5 時期，SiLOX7基因在YG1 和LG25 中的表達量高于QH2 和JG21。整體上看，在S5 時期，SiLOX基因在YG1 和LG25 中的表達量高于在QH2 和JG21 中的表達量，這個趨勢和上述結果中4 個谷子品種小米褪色率一致，推測谷子灌漿末期SiLOX基因的表達會顯著影響小米色澤變化，SiLOX基因是調控小米褪色的關鍵基因，它在小米儲藏過程中的褪色反應中發揮了主要作用。

圖3 3 個基因在4 個谷子品種籽粒灌漿期表達比較Fig.3 Comparison of relative expression of three genes in different filling peirods of four varieties of foxmail millet

3 結論與討論

據文獻記載，不同品種的小米色澤也會有差異[20-21]，米色是評價小米品質的重要指標，直接反映小米品質的優劣。有研究表明，單穗質量和單穗粒質量與米色呈極顯著正相關[22]。與水稻和小麥相比，小米富含多種營養物質[5，19]。因此，研究影響其色澤的因素是非常必要的。類胡蘿卜素是小米中黃色素的主要成分，是一種非常重要的營養物質[18]。本研究中，儲藏11 個月的小米b*值整體降低，在儲藏過程中呈現先緩慢上升后下降的趨勢。鄭文寅等[23]研究表明，類胡蘿卜素含量與小麥面粉的黃度呈極顯著正相關，與本研究結果一致。本研究表明，儲藏過程中b*值變化趨勢與總類胡蘿卜素含量的變化趨勢一致，均呈現先升高后下降的趨勢，說明米色和總類胡蘿卜素含量密切相關。

HOWITT 等[24]研究發現，類胡蘿卜素含量較高的小麥品種的LOX 活性會相對較低，表明類胡蘿卜素含量與LOX 活性間呈顯著負相關。本研究中，小米籽粒的LOX 活性不穩定，在儲藏5～7 個月時LOX 活性達到最高，隨后又逐漸下降。JG21 的LOX 活性一直處于最低水平，但類胡蘿卜素含量處于最高水平，這與HOWITT 等[24]、鄭文寅等[23]研究結果一致。有研究發現[25-27]，LOX 不會直接作用于類胡蘿卜素，相反會在催化過程中產生氫過氧脂肪酸，使類胡蘿卜素共氧化和脫色，進而導致類胡蘿卜素的降解。在本研究中，當LOX 活性達到最大時，谷子中類胡蘿卜素降解也會加快。由此推測，LOX 活性會影響谷子儲藏過程中類胡蘿卜素的降解。

在水稻中，通過RNA 干擾技術使用糊粉層和胚特異性Oleosin-18 啟動子將高類胡蘿卜素水稻種子中r9-LOX1基因抑制，降低內源LOX 活性，在人工老化處理RNAi 的轉基因黃金水稻T3 中檢測其貯存穩定性。結果表明，在人工老化之后，RNAi的黃金水稻由于β-胡蘿卜素共氧化的減弱而使得轉基因稻植物中LOX 活性大量降低，而β-胡蘿卜素富集的轉基因稻（SKBR-244）中，LOX 活性明顯高于RNA 干擾株系。證明LOX 是催化β-胡蘿卜素共氧化的一個關鍵酶，且在黃金大米中對β-胡蘿卜素含量降低有顯著的降低作用[12]。CARRERA等[28]研究表明，Lpx-B1與硬粒小麥中類胡蘿卜素含量相關，小麥中該基因表達水平越高，其類胡蘿卜素越易降解，LOX3 是水稻種子儲藏過程中的關鍵酶，LOX3基因的缺失可顯著提高水稻種子的耐儲藏性[29]。孫道杰等[11]研究表明，小麥中LOX 活性是影響面粉黃色素含量的主要因素之一。本研究探索了SiLOX3、SiLOX4、SiLOX7這3 個基因的表達量，結果表明，SiLOX3、SiLOX4、SiLOX7這3 個基因在4 個谷子品種籽粒不同成熟時期的表達量可能與小米褪色和類胡蘿卜素降解相關，證明這3 個基因在4 個谷子品種不同發育時期表達量的差異會影響小米類胡蘿卜素降解和色澤變化。

本研究中，經過11 個月的儲藏，4 個谷子品種的小米黃度、總類胡蘿卜素含量、LOX 活性都會下降，在儲藏中期會稍有回升然后再下降。S5 時期，SiLOX4、SiLOX7基因的表 達量在YG1 中明顯 提高，且YG1 的類胡蘿卜素含量最低，因此，推測SiLOX3、SiLOX4、SiLOX7基因可能參與了小米儲藏過程中類胡蘿卜素的降解，進而導致小米褪色。

本試驗通過對儲藏期間4 個名優谷子品種的米色、類胡蘿卜素、LOX 活性以及LOX基因在不同品種不同籽粒灌漿時期的表達量進行對比分析，發現LOX基因在4 個谷子品種、籽粒不同灌漿期的差異性表達可能是導致谷子品種褪色快慢和類胡蘿卜素降解速率不同的原因。