微波輔助提取花生紅衣和花生殼中多酚物質及抗氧化活性對比研究

溫志英，郭清爽，劉 坤，趙 飛

（1.河北經貿大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050061；2.河北經貿大學工商管理學院，河北石家莊 050061）

花生（Arachis hypogaea L.）是全球最重要的四大油料作物（油菜、大豆、花生、芝麻）之一。我國是世界花生生產大國和花生加工利用強國[1]，2018 年花生年總產量1 733.2 萬t，居世界首位[2]。花生殼和紅衣是花生的副產物，我國年產花生殼約520 萬t，花生紅衣600 t，除了少部分被用作中藥、飼料和燃料外，資源浪費極其嚴重[3-4]。

Francisco M L 等人[5]、Elsorady M E 等人[6]和Adhikari B 等人[7]研究表明花生皮、殼含有豐富的多酚類物質（白藜蘆醇、原花色素、黃酮類等），具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等生物活性，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無毒的新型天然抗氧化劑。劉翠等人[8-9]的研究表明花生紅衣多酚還是有效的食品防腐保鮮劑。微波輔助提取（MAE）具有提取時間短、效率高、能耗低的特點，同時能降低熱敏性物質降解風險，是一種環境友好的綠色提取技術[10-13]。因此，通過微波輔助工藝提取花生皮、殼中的多酚類物質，并對其抗氧化活性進行比較研究。試驗參考Jayaprakasha G 等人[14]的方法，以抗壞血酸當量濃度（mg AA/g）表示花生紅衣、花生殼DPPH 自由基的清除能力，目前在國內未見報道。研究成果對于有效利用我國豐富的花生紅衣和花生殼資源中的天然多酚活性成分，實現循環農業和循環經濟具有深遠意義。

1 材料與設備

1.1 材料

花生紅衣、花生殼，市售帶殼花生手工剝殼。

1.2 試劑

沒食子酸（Gallic acid，GA），抗壞血酸（Ascorbic acid，AA），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），福林酚試劑，Sigma-Aldrich 公司提供；無水Na2CO3、無水乙醇、甲醇、硫酸亞鐵、水楊酸，均為分析純。

1.3 儀器與設備

HH-4 型恒溫水浴鍋、RA-8 微波萃取儀、DFY-300 g 搖擺式高速中藥粉碎機、SHD-Ⅲ型循環水式多用真空泵、722E 型分光光度計、72-1 型電熱恒溫干燥箱、800 型離心沉淀器、Synergy HT 多功能酶標儀等。

1.4 試驗方法

1.4.1 花生皮、殼預處理

花生皮、殼→50 ℃下恒溫鼓風干燥箱干燥4 h→粉碎機粉碎→過40 目篩→正己烷浸提脫脂24 h→-20 ℃冰箱密封避光儲存，備用。

1.4.2 花生紅衣、花生殼多酚提取

花生皮殼粉末→稱量→乙醇水溶液恒溫浴振蕩（160 r/min，60 ℃）10 min→微波萃取→離心→取上清液→定容→測定吸光度→計算花生紅衣、花生殼多酚得率（以當量沒食子酸(GA)表示）。

式中：A——吸光度；

m——稀釋倍數；

n——提取液體積，mL；

G——花生紅衣、花生殼質量，g。

1.4.3 多酚含量的測定

多酚的含量測定采用Folin-Ciocalteu 法[15]。沒食子酸回歸方程：Y=0.006 1X+0.077 7，R2=0.999 6。

沒食子酸標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線

1.4.4 花生紅衣、花生殼多酚類化合物的體外抗氧化活性研究

（1）DPPD 自由基清除能力測定。以抗壞血酸（AA，0.02 mg/mL）作為對照標準，其體外抗氧化活性作用以抗壞血酸當量表示mg AA/g，采用Jayaprakasha G 等人[14]的方法測定DPPD 自由基清除能力測定。

抗壞血酸標準曲線見圖2。

圖2 抗壞血酸標準曲線

（2）羥基自由基的清除能力測定。采用水楊酸法[16-17]。

1.5 數據處理

采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析，應用單因素方差分析（ANOVA）及Duncan's 多重檢驗進行顯著性分析，以p＜0.05 為差異具有統計學意義。數值以均質±標準差SD 表示。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

準確稱取2 g 花生紅衣、花生殼粉末，料液比1∶40，加入不同體積分數的乙醇溶液，微波功率240 W，微波提取時間30 s，其余步驟同1.4.2。

乙醇體積分數對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見圖3。

由圖3 可知，花生紅衣多酚在乙醇體積分數為80%時得率最高為137.11 mg GA/g，而花生殼多酚在乙醇體積分數為60%時得率最高為15.34 mg GA/g。得率先升高后下降是由于不同體積分數乙醇極性不同，根據相似相溶原理，多酚在極性最相似的溶液中溶出最高，得率最大。由于花生紅衣與花生殼二者多酚的具體成分差異較大，花生紅衣中的酚類物質以原兒茶酸、兒茶素、原花青素為主[9]，而花生殼中主要為木犀草素[18-19]，故而乙醇體積分數對二者的影響不同。

圖3 乙醇體積分數對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

2.1.2 微波功率對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

分別以80%，60%的乙醇為提取劑提取花生紅衣、花生殼多酚，微波功率為160，320，480，640，800 W，其余條件同2.1.1 進行微波提取。

微波功率對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見圖4。

圖4 微波功率對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

由圖4 可知，隨微波功率的增大，總多酚得率增加，但繼續增大微波功率，多酚得率下降。花生紅衣在微波功率達到480 W 時，多酚得率最大為138.07 mg GA/g，花生殼在微波功率640 W時達到最大為18.96 mg GA/g。可能是因為適當的微波功率有利于花生紅衣中多酚的溶出，但過高的微波功率則有可能破壞多酚類化合物，致使其得率下降。

2.1.3 料液比對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

花生紅衣（80%乙醇，480 W），花生殼（60%乙醇、640 W），料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，其余條件同2.1.1 進行微波提取。

料液比對花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見圖5。

圖5 料液比對花生紅衣、殼多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著料液比的增加，多酚得率逐漸增加，當料液比為1∶40 時，花生紅衣、花生殼多酚得率均最大，之后增加料液比，多酚得率有所下降，由此可見增大料液比有利于多酚物質溶出，當料液比為1∶40 時，多酚溶出達到最高，當料液比繼續增大會造成雜質過多的流出從而阻止了多酚類化合物的溶解，影響得率。料液比為1∶40 時，花生紅衣、花生殼的多酚得率分別為145.02 mg GA/g和19.82 mg GA/g。

2.1.4 微波時間對多酚得率的影響

花生紅衣（80%乙醇，480 W），花生殼（60%乙醇，640 W），料液比為1∶40，其他條件同2.1.1。

微波時間對花生殼多酚得率的影響見圖6。

圖6 微波時間對花生殼多酚得率的影響

由圖6 可知，在10～40 s 內隨著微波時間增加，總多酚得率也隨之增加，在40～60 s 內得率下降，當微波時間為40 s 時多酚得率最高，這是因為微波有利于多酚的溶出，但當微波時間過長則會降解或破壞已溶出的多酚類化合物，導致總多酚得率下降，這與Ekezie F G 等人[10]和Zhang G 等人[12]的研究結果一致。微波時間40 s 時，花生紅衣、花生殼多酚得率分別為145.96 mg GA/g 和20.55 mg GA/g。

2.2 正交試驗

2.2.1 花生紅衣多酚正交試驗

根據正交試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取乙醇體積分數、料液比、微波時間3 個對花生紅衣多酚得率影響顯著的因素，采用三因素三水平的正交試驗L9（34）優化提取工藝[19]。

花生紅衣多酚正交試驗結果見表1，花生紅衣正交試驗方差分析見表2。

表1 花生紅衣多酚正交試驗結果

由表2 可知，影響花生紅衣多酚得率的因素從大到小為A＞B＞C，A 和B 對提取有極顯著影響，C對提取有顯著影響。最佳工藝條件為A2B2C2，即乙醇體積分數80%，料液比1∶40，微波時間40 s。按照1.4.2 方法進行提取，試驗重復3 次，花生紅衣多酚得率為179.20 mg GA/g，高于李娜等人[18]報道的147.72 mg GA/g，與Francisco M L 等人[20]研究報道花生紅衣中的多酚含量在110～280 mg GA/g 試驗結果一致。

表2 花生紅衣正交試驗方差分析

2.2.2 花生殼多酚正交試驗

根據正交試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取微波功率、料液比、微波時間為三因素，采用三因素三水平的正交試驗L9（34）優化提取工藝。

花生殼多酚正交試驗結果見表3，花生殼正交試驗方差分析見表4。

表3 花生殼多酚正交試驗結果

表4 花生殼正交試驗方差分析

由表4 可知，影響花生紅衣多酚得率的因素從大到小為A'＞B'＞C'，三者對提取有極顯著影響。最佳工藝條件為A'3B'2C'2，即微波功率800 W，料液比1∶40，微波時間40 s。以60%乙醇為提取液，按照1.4.2 方法進行提取，試驗重復3 次，得花生殼多酚得率為20.63 mg GA/g。

2.3 花生紅衣、花生殼多酚類對DPPH 自由基的清除能力

花生紅衣、花生殼多酚抗氧化活性比較見圖7。

圖7 花生紅衣、花生殼多酚抗氧化活性比較

由圖7（a）可知，當質量濃度為0.005 mg/mL時，花生紅衣多酚、抗壞血酸、花生殼多酚DPPH自由基清除率分別為72.28%，56.40%，32.27%，花生紅衣多酚對自由基的清除能力顯著高于花生殼多酚，同時優于抗壞血酸，具有顯著差異（p＜0.05）；當質量濃度為0.007 5 mg/mL 時，花生紅衣和抗壞血酸清除率分別為85.59%和84.16%，差異不顯著（p＜0.05）。在質量濃度為0.000 5～0.007 5 mg/mL 時，抗壞血酸對DPPH·的清除率與質量濃度呈現線性相關性，回歸方程為Y=10 885X+1.823 3，R2=0.999 3。根據抗壞血酸標準曲線，花生紅衣多酚的當量抗壞血酸為131.56±2.20 mg AA/g，花生殼多酚的當量抗壞血酸為6.51±0.71 mg AA/g。因此，花生紅衣清除DPPH 自由基能力顯著高于花生殼（p＜0.05），與李娜等人[18]和Meng W 等人[21]已報道的研究成果一致。

2.4 花生紅衣、花生殼多酚對羥基自由基清除能力

由圖7（b）可知，花生紅衣、花生殼多酚對羥基自由基有清除能力均隨著花生紅衣、花生殼多酚質量濃度增加而增強，當多酚質量濃度為0.015 mg/mL 時，花生皮、殼多酚的·OH 清除率分別為51.86%和43.26%，花生紅衣多酚的清除羥基自由基能力顯著高于花生殼多酚（p＜0.05）。

3 結論

花生紅衣微波輔助提取多酚物質的最佳提取工藝為乙醇體積分數80%，料液比1∶40，微波功率480 W，微波時間40 s，花生紅衣多酚得率為179.20 mg GA/g；花生殼微波輔助提取多酚物質的最佳提取工藝為乙醇體積分數60%，料液比為1∶40，微波功率800 W，微波時間40 s，花生殼多酚得率為20.63 mg GA/g。

花生紅衣的DPPH 自由基清除能力和羥基自由基清除能力均優于花生殼。花生紅衣DPPH 自由基清除能力優于抗壞血酸，其當量抗壞血酸為131.56±2.20 mg AA/g，花生殼的當量抗壞血酸為6.51±0.71 mg AA/g。由此可見，花生皮、殼多酚均具有抗氧化性，花生紅衣抗氧化性尤為突出，是一種優良的天然抗氧化劑，為開發花生皮殼等農業廢棄物資源提供了依據。