微波輔助提取花生紅衣和花生殼中多酚物質(zhì)及抗氧化活性對(duì)比研究

溫志英，郭清爽，劉 坤，趙 飛

（1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050061；2.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)工商管理學(xué)院，河北石家莊 050061）

花生（Arachis hypogaea L.）是全球最重要的四大油料作物（油菜、大豆、花生、芝麻）之一。我國(guó)是世界花生生產(chǎn)大國(guó)和花生加工利用強(qiáng)國(guó)[1]，2018 年花生年總產(chǎn)量1 733.2 萬(wàn)t，居世界首位[2]。花生殼和紅衣是花生的副產(chǎn)物，我國(guó)年產(chǎn)花生殼約520 萬(wàn)t，花生紅衣600 t，除了少部分被用作中藥、飼料和燃料外，資源浪費(fèi)極其嚴(yán)重[3-4]。

Francisco M L 等人[5]、Elsorady M E 等人[6]和Adhikari B 等人[7]研究表明花生皮、殼含有豐富的多酚類(lèi)物質(zhì)（白藜蘆醇、原花色素、黃酮類(lèi)等），具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤等生物活性，可作為防癌、抗突變、防治心血管疾病藥物的主要有效成分和用作安全無(wú)毒的新型天然抗氧化劑。劉翠等人[8-9]的研究表明花生紅衣多酚還是有效的食品防腐保鮮劑。微波輔助提取（MAE）具有提取時(shí)間短、效率高、能耗低的特點(diǎn)，同時(shí)能降低熱敏性物質(zhì)降解風(fēng)險(xiǎn)，是一種環(huán)境友好的綠色提取技術(shù)[10-13]。因此，通過(guò)微波輔助工藝提取花生皮、殼中的多酚類(lèi)物質(zhì)，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行比較研究。試驗(yàn)參考Jayaprakasha G 等人[14]的方法，以抗壞血酸當(dāng)量濃度（mg AA/g）表示花生紅衣、花生殼DPPH 自由基的清除能力，目前在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。研究成果對(duì)于有效利用我國(guó)豐富的花生紅衣和花生殼資源中的天然多酚活性成分，實(shí)現(xiàn)循環(huán)農(nóng)業(yè)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)具有深遠(yuǎn)意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

花生紅衣、花生殼，市售帶殼花生手工剝殼。

1.2 試劑

沒(méi)食子酸（Gallic acid，GA），抗壞血酸（Ascorbic acid，AA），1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），福林酚試劑，Sigma-Aldrich 公司提供；無(wú)水Na2CO3、無(wú)水乙醇、甲醇、硫酸亞鐵、水楊酸，均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

HH-4 型恒溫水浴鍋、RA-8 微波萃取儀、DFY-300 g 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)、SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、722E 型分光光度計(jì)、72-1 型電熱恒溫干燥箱、800 型離心沉淀器、Synergy HT 多功能酶標(biāo)儀等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 花生皮、殼預(yù)處理

花生皮、殼→50 ℃下恒溫鼓風(fēng)干燥箱干燥4 h→粉碎機(jī)粉碎→過(guò)40 目篩→正己烷浸提脫脂24 h→-20 ℃冰箱密封避光儲(chǔ)存，備用。

1.4.2 花生紅衣、花生殼多酚提取

花生皮殼粉末→稱(chēng)量→乙醇水溶液恒溫浴振蕩（160 r/min，60 ℃）10 min→微波萃取→離心→取上清液→定容→測(cè)定吸光度→計(jì)算花生紅衣、花生殼多酚得率（以當(dāng)量沒(méi)食子酸(GA)表示）。

式中：A——吸光度；

m——稀釋倍數(shù)；

n——提取液體積，mL；

G——花生紅衣、花生殼質(zhì)量，g。

1.4.3 多酚含量的測(cè)定

多酚的含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteu 法[15]。沒(méi)食子酸回歸方程：Y=0.006 1X+0.077 7，R2=0.999 6。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.4.4 花生紅衣、花生殼多酚類(lèi)化合物的體外抗氧化活性研究

（1）DPPD 自由基清除能力測(cè)定。以抗壞血酸（AA，0.02 mg/mL）作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，其體外抗氧化活性作用以抗壞血酸當(dāng)量表示mg AA/g，采用Jayaprakasha G 等人[14]的方法測(cè)定DPPD 自由基清除能力測(cè)定。

抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

（2）羥基自由基的清除能力測(cè)定。采用水楊酸法[16-17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA）及Duncan's 多重檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以p＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)值以均質(zhì)±標(biāo)準(zhǔn)差SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g 花生紅衣、花生殼粉末，料液比1∶40，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，微波功率240 W，微波提取時(shí)間30 s，其余步驟同1.4.2。

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，花生紅衣多酚在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)得率最高為137.11 mg GA/g，而花生殼多酚在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)得率最高為15.34 mg GA/g。得率先升高后下降是由于不同體積分?jǐn)?shù)乙醇極性不同，根據(jù)相似相溶原理，多酚在極性最相似的溶液中溶出最高，得率最大。由于花生紅衣與花生殼二者多酚的具體成分差異較大，花生紅衣中的酚類(lèi)物質(zhì)以原兒茶酸、兒茶素、原花青素為主[9]，而花生殼中主要為木犀草素[18-19]，故而乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)二者的影響不同。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

2.1.2 微波功率對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

分別以80%，60%的乙醇為提取劑提取花生紅衣、花生殼多酚，微波功率為160，320，480，640，800 W，其余條件同2.1.1 進(jìn)行微波提取。

微波功率對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 微波功率對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

由圖4 可知，隨微波功率的增大，總多酚得率增加，但繼續(xù)增大微波功率，多酚得率下降。花生紅衣在微波功率達(dá)到480 W 時(shí)，多酚得率最大為138.07 mg GA/g，花生殼在微波功率640 W時(shí)達(dá)到最大為18.96 mg GA/g。可能是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)奈⒉üβ视欣诨ㄉt衣中多酚的溶出，但過(guò)高的微波功率則有可能破壞多酚類(lèi)化合物，致使其得率下降。

2.1.3 料液比對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響

花生紅衣（80%乙醇，480 W），花生殼（60%乙醇、640 W），料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，其余條件同2.1.1 進(jìn)行微波提取。

料液比對(duì)花生紅衣、花生殼多酚得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 料液比對(duì)花生紅衣、殼多酚得率的影響

由圖5 可知，隨著料液比的增加，多酚得率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，花生紅衣、花生殼多酚得率均最大，之后增加料液比，多酚得率有所下降，由此可見(jiàn)增大料液比有利于多酚物質(zhì)溶出，當(dāng)料液比為1∶40 時(shí)，多酚溶出達(dá)到最高，當(dāng)料液比繼續(xù)增大會(huì)造成雜質(zhì)過(guò)多的流出從而阻止了多酚類(lèi)化合物的溶解，影響得率。料液比為1∶40 時(shí)，花生紅衣、花生殼的多酚得率分別為145.02 mg GA/g和19.82 mg GA/g。

2.1.4 微波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

花生紅衣（80%乙醇，480 W），花生殼（60%乙醇，640 W），料液比為1∶40，其他條件同2.1.1。

微波時(shí)間對(duì)花生殼多酚得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 微波時(shí)間對(duì)花生殼多酚得率的影響

由圖6 可知，在10～40 s 內(nèi)隨著微波時(shí)間增加，總多酚得率也隨之增加，在40～60 s 內(nèi)得率下降，當(dāng)微波時(shí)間為40 s 時(shí)多酚得率最高，這是因?yàn)槲⒉ㄓ欣诙喾拥娜艹觯?dāng)微波時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)降解或破壞已溶出的多酚類(lèi)化合物，導(dǎo)致總多酚得率下降，這與Ekezie F G 等人[10]和Zhang G 等人[12]的研究結(jié)果一致。微波時(shí)間40 s 時(shí)，花生紅衣、花生殼多酚得率分別為145.96 mg GA/g 和20.55 mg GA/g。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 花生紅衣多酚正交試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間3 個(gè)對(duì)花生紅衣多酚得率影響顯著的因素，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化提取工藝[19]。

花生紅衣多酚正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，花生紅衣正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表2。

表1 花生紅衣多酚正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，影響花生紅衣多酚得率的因素從大到小為A＞B＞C，A 和B 對(duì)提取有極顯著影響，C對(duì)提取有顯著影響。最佳工藝條件為A2B2C2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶40，微波時(shí)間40 s。按照1.4.2 方法進(jìn)行提取，試驗(yàn)重復(fù)3 次，花生紅衣多酚得率為179.20 mg GA/g，高于李娜等人[18]報(bào)道的147.72 mg GA/g，與Francisco M L 等人[20]研究報(bào)道花生紅衣中的多酚含量在110～280 mg GA/g 試驗(yàn)結(jié)果一致。

表2 花生紅衣正交試驗(yàn)方差分析

2.2.2 花生殼多酚正交試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取微波功率、料液比、微波時(shí)間為三因素，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化提取工藝。

花生殼多酚正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，花生殼正交試驗(yàn)方差分析見(jiàn)表4。

表3 花生殼多酚正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 花生殼正交試驗(yàn)方差分析

由表4 可知，影響花生紅衣多酚得率的因素從大到小為A'＞B'＞C'，三者對(duì)提取有極顯著影響。最佳工藝條件為A'3B'2C'2，即微波功率800 W，料液比1∶40，微波時(shí)間40 s。以60%乙醇為提取液，按照1.4.2 方法進(jìn)行提取，試驗(yàn)重復(fù)3 次，得花生殼多酚得率為20.63 mg GA/g。

2.3 花生紅衣、花生殼多酚類(lèi)對(duì)DPPH 自由基的清除能力

花生紅衣、花生殼多酚抗氧化活性比較見(jiàn)圖7。

圖7 花生紅衣、花生殼多酚抗氧化活性比較

由圖7（a）可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.005 mg/mL時(shí)，花生紅衣多酚、抗壞血酸、花生殼多酚DPPH自由基清除率分別為72.28%，56.40%，32.27%，花生紅衣多酚對(duì)自由基的清除能力顯著高于花生殼多酚，同時(shí)優(yōu)于抗壞血酸，具有顯著差異（p＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.007 5 mg/mL 時(shí)，花生紅衣和抗壞血酸清除率分別為85.59%和84.16%，差異不顯著（p＜0.05）。在質(zhì)量濃度為0.000 5～0.007 5 mg/mL 時(shí)，抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除率與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)性，回歸方程為Y=10 885X+1.823 3，R2=0.999 3。根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，花生紅衣多酚的當(dāng)量抗壞血酸為131.56±2.20 mg AA/g，花生殼多酚的當(dāng)量抗壞血酸為6.51±0.71 mg AA/g。因此，花生紅衣清除DPPH 自由基能力顯著高于花生殼（p＜0.05），與李娜等人[18]和Meng W 等人[21]已報(bào)道的研究成果一致。

2.4 花生紅衣、花生殼多酚對(duì)羥基自由基清除能力

由圖7（b）可知，花生紅衣、花生殼多酚對(duì)羥基自由基有清除能力均隨著花生紅衣、花生殼多酚質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為0.015 mg/mL 時(shí)，花生皮、殼多酚的·OH 清除率分別為51.86%和43.26%，花生紅衣多酚的清除羥基自由基能力顯著高于花生殼多酚（p＜0.05）。

3 結(jié)論

花生紅衣微波輔助提取多酚物質(zhì)的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶40，微波功率480 W，微波時(shí)間40 s，花生紅衣多酚得率為179.20 mg GA/g；花生殼微波輔助提取多酚物質(zhì)的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比為1∶40，微波功率800 W，微波時(shí)間40 s，花生殼多酚得率為20.63 mg GA/g。

花生紅衣的DPPH 自由基清除能力和羥基自由基清除能力均優(yōu)于花生殼。花生紅衣DPPH 自由基清除能力優(yōu)于抗壞血酸，其當(dāng)量抗壞血酸為131.56±2.20 mg AA/g，花生殼的當(dāng)量抗壞血酸為6.51±0.71 mg AA/g。由此可見(jiàn)，花生皮、殼多酚均具有抗氧化性，花生紅衣抗氧化性尤為突出，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，為開(kāi)發(fā)花生皮殼等農(nóng)業(yè)廢棄物資源提供了依據(jù)。