奶粉中香蘭素甲基香蘭素和乙基香蘭素UPLC-MS/MS 法的不確定度評定

陳海南，周建峰

（溫州市質量技術檢測科學研究院，浙江溫州 325000）

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素是行業(yè)中重要的廣譜型高檔香料，是目前全球產(chǎn)量最大的香料之一，具有清甜的豆香、粉香氣息，可用作定香劑、協(xié)調劑及調味劑，廣泛應用于食品、飲料、化妝品、日用化學品及醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。作為天然香料，廣泛存在與自然界中，甲基香蘭素、乙基香蘭素則是化學合成物質，3 種物質均有濃烈奶香味，具有增進食欲、提高食品品質、恢復食品香味、強化特征味道及消殺食品中不良味道的效果。

目前研究指出，過量食用香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素可以導致頭暈、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至能夠損傷肝、腎，對人體健康有較大危害[3]。在食用奶粉最大的嬰兒群體中，研究數(shù)據(jù)顯示過多食用添加香蘭素等添加劑的奶粉后，會使嬰兒對其產(chǎn)生依賴性，時間越長、吃得越多，小嬰兒或將更易染上偏食、挑食、厭食等不良飲食習慣，使得攝入營養(yǎng)不全。

國家衛(wèi)計委發(fā)布實施的GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[4]明確指出不得添加任何食用香料、香精有27 種食品，其中包括巴氏殺菌乳、滅菌乳、發(fā)酵乳、無水黃油、稀奶油和嬰幼兒配方乳粉等多種乳制品，而且規(guī)定，0～6 個月的嬰幼兒配方食品不得添加任何食品用香料，香蘭素在嬰幼兒谷類輔助食品中可以使用[5]，但最大使用量不得超過7 mg/100 g，美國食品香料與萃取物制造者協(xié)會（FEMA）建議軟飲料中香蘭素的用量為6.3 mg/100 g。國家企業(yè)信用信息公示系統(tǒng)顯示，2020 年12 月，國家市場監(jiān)督管理總局在單一批次雅培一款0～6 月齡1 段嬰兒配方奶粉的抽檢中檢出極微量香蘭素，香蘭素項目實測值為171.6 μg/kg。經(jīng)過調查，造成涉事批次產(chǎn)品香蘭素不合格的原因是雅培集團愛爾蘭工廠在生產(chǎn)線更換品種生產(chǎn)時，對生產(chǎn)管道清洗不徹底，致使生產(chǎn)管道中殘留了前序產(chǎn)品含有的香蘭素，造成涉事批次產(chǎn)品香蘭素成分污染[6-7]。

目前，對香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素沒有相應的國家檢測標準和方法，只有地方標準《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定BJS 201705》[8]。國內對于該3 種香料的研究，也有許多研究已經(jīng)涉及并開發(fā)檢測方法，有對植物油中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的高效液相色譜串聯(lián)質譜的測定[1]，有對于米粉中香蘭素和乙基香蘭素含量的測定[9]，有氣相色譜法測定椰子汁或復原椰子汁中5 種香料等[10]。對于香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的含量測定[11-22]，除了必要的檢測方法外，還需要關注測量結果的不確定度。現(xiàn)可查閱的文獻只有一篇關于氣相色譜質譜法測定奶粉中香蘭素的不確定度評估[23]，且不涉及另外2 種香蘭素香味劑。因此，依據(jù)CNAS-GL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》[24]、JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[25]、JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[26]和地方標準《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定BJS 201705》，研究了奶粉中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素含量的不確定進行測定和分析，為準確測定奶粉中香味劑含量提供更加科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶粉，市售；香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素標準品（純度≥98.0%）；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；正己烷，色譜純；氯化鈉，分析純；水為GB/T 6682 規(guī)定的一級水；孔濾膜（孔徑為0.22 μm 有機相微孔濾膜），上海安譜公司提供。

1.2 儀器與設備

Agilent1290/6470 型三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質譜，配ESI 源，美國安捷倫公司產(chǎn)品；IKA MS3型渦旋振蕩器，德國IKA 公司產(chǎn)品；SIGMA3K15 型冷凍離心機（轉速≥5 000 r/min），美國Sigma 公司產(chǎn)品；Research Plus 型微量移液器，德國艾本德公司產(chǎn)品；Millipore 型超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore公司產(chǎn)品；SK5200H 型超聲波清洗器，上?？茖С晝x器公司產(chǎn)品；HCB1002 型分析天平，艾德姆衡器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

（1）標準儲備液（1.00 mg/mL）。分別稱取香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素0.1 g；（精確至0.000 1 g）標準物質于100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。于-18 ℃下避光保存。

（2）混合標準儲備溶液。分別吸取上述3 種標準儲備液100 μL 于同一個100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋到刻度配制成質量濃度為1.0 μg/mL 的混合標準儲備溶液，于-18 ℃下避光保存。

（3）空白基質溶液。按照前處理方法操作制備空白基質溶液。

（4）基質混合標準系列工作液。分別準確吸取香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素混合標準儲備液適量，用空白基質提取液將其稀釋為10，20，40，80，160 ng/mL 標準系列工作溶液，臨用時現(xiàn)配。

1.3.2 樣品前處理

稱取1 g 樣品（精確至0.01 g），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入3 mL 水，渦旋振蕩30 s，加入7 mL 乙腈，渦旋振蕩30 s，超聲處理25 min，以轉速10 000 r/min 離心5 min 后，取上層清液2 mL 于10 mL 玻璃離心管中，加入1 mL 正己烷，渦旋混合30 s，以轉速5 000 r/min 離心3min 后，取下層清液，過濾膜（0.22 μm，有機相），待分析。

1.3.3 儀器分析參考條件

（1）液相部分設置。色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），美國安捷倫公司產(chǎn)品；液相流速0.3 mL/min；柱溫箱溫度30 ℃；進樣體積2 μL；流動相A 為甲醇；流動相B 為含0.1%甲酸的水；程序洗脫條件為0～0.5 min，75% A；0.5～2.0 min，75%→50% A；2～6 min，50%A；6～7 min，50%→10% A；7～9 min，10% A；9～12 min，10%→75%。

（2）質譜部分設置。離子源：電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子掃描（ESI+），檢測方式為多反應監(jiān)測（MRM）。

化合物的質譜參數(shù)見表1。

表1 化合物的質譜參數(shù)

1.3.4 不確定度數(shù)學模型的組建

待測組分含量計算：

式中：X——待測組分含量，μg/kg；

C——待測組分在標準曲線中所得溶液質量濃度，ng/mL；

V——定容體積，mL；

m——稱量樣品的質量，g。

2 結果與分析

2.1 分析檢測過程不確定度的因素

分析整個測定過程，對奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素測量值的不確定度影響因素如下：樣品稱量Urel(A)，樣品提取過程Urel(B)，標準物質的純度Urel(C)，標準溶液稱量稀釋過程Urel(D)，標準工作曲線擬合Urel(E)，重復性測量Urel(F)，測量回收率Urel(G)，測量儀器Urel(H)。相對標準不確定度合成表示為：

2.2 不確定度因素的分析

2.2.1 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度

檢測方法使用百分之一的天平作為稱量設備（艾德姆衡器電子天平HCB1002），檢測方法中要求稱取1 g 樣品，稱量天平由溫州計量院檢定，證書編號為（CA210105758），該證書提供的允許誤差為±0.01 g，在分布均勻的條件下，=0.005 77，稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度為：=0.005 77。

2.2.2 樣品提取過程產(chǎn)生的不確定度

該檢測方法在提取過程中涉及的準確體積量為3 mL 水和7 mL 乙腈，最終定容體積可視為10.0 mL。檢測過程使用10.0 mL 移液管，由溫州計量院檢定，證書編號為（CA210610218），最大允許誤差為±0.05 mL。由移液管移取過程產(chǎn)生的相對不確定度為=0.003 849 1，=0.001 649 6。已知水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.4×10-3℃-1，測量實驗室的溫度為20±5 ℃，依據(jù)95%置信概率條件（k=1.96），在提取過程中溫度影響產(chǎn)生的不確定度為：

由樣品提取過程產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

樣品提取過程產(chǎn)生的不確定度：

2.2.3 標準物質純度產(chǎn)生的不確定度

由香蘭素標準物質證書可知，純度為99.9%，當k=2 時在95%置信區(qū)間上擴展不確定度U=0.5%，則產(chǎn)生的相對標準不確定度為=0.002 50；而由甲基香蘭素證書和乙基香蘭素證書提供的純度分別為99.4%和99.9%，當k=2 時在95%置信區(qū)間上擴展不確定度分別為U=2%和U=0.5%，可以得出產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

2.2.4 標準物質配制稀釋過程產(chǎn)生的不確定度

計算香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素標準物質配制稀釋過程的不確定因素：

（3）三次配制，配制成香蘭素標準物質系列曲線工作液。用200 μL 移液器分別移取10，20，40，80，160 μL，將1.0 μg/mL 香蘭素標準物質中間工作液定容到1 mL 容量瓶里，并用空白基質定容，得到10，20，40，80，160 ng/mL 的系列標準物質工作液。200 μL 移液器需要使用5 次，1 mL 容量瓶使用5 次。依據(jù)JJG 646—2006《移液器 檢定規(guī)程》[28]的要求，按矩形分布計算，則香蘭素標準物質系列曲線工作液配制產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

系列標準物質工作液配制產(chǎn)生的不確定度見表2。

表2 系列標準物質工作液配制產(chǎn)生的不確定度

通過3 次配制過程，產(chǎn)生的香蘭素配制稀釋過程的合成相對標準不確定度為：

由以上香蘭素相對標準不確定度計算過程可以得出甲基香蘭素和乙基香蘭素的配制稀釋過程產(chǎn)生的相對標準不確定度為Urel(D甲基香蘭素)和Urel(D乙基香蘭素)為0.022 068 58。

2.2.5 標準工作曲線擬合產(chǎn)生的不確定度

使用標準物質工作液10，20，40，80，160 ng/mL的各個質量濃度點，同一個質量濃度分別測定3 次，5 個濃度點計5×3=15 次，依據(jù)最小二乘法擬合標準曲線，得到3 種物質的3 條線性回歸方程：Y=aX+b。對待測樣品的重復測定次數(shù)為6 次，則擬合標準工作曲線產(chǎn)生的不確定度為：

式中：S——單一峰響應值的標準偏差；

a——擬合曲線斜率；

b——擬合曲線截距值；

n——擬合曲線時，標準濃度點的測定次數(shù)；

X——被測樣品的濃度最佳估計值；

X——標準曲線各個濃度點的平均值；

Xi——標準曲線系列濃度點的值；

Y——標準曲線中各濃度點對應的峰面積響應值。

標準工作曲線點濃度-峰面積響應值對應表見表3。

表3 標準工作曲線點濃度-峰面積響應值對應表

后續(xù)得到曲線，5 個點計15 個質量濃度點測定數(shù)的峰面積響應值，代入公式得出香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素由標準工作曲線擬合產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

2.2.6 重復性測量產(chǎn)生的不確定度

在相同的測量條件下，對6 份空白奶粉樣品做600.0 μg/kg 水平的混合標準工作液添加測量試驗，按照標準方法測定。

重復性測量結果和測量回收率見表4。

表4 重復性測量結果和測量回收率

依據(jù)貝塞爾（Besssel）公式，合成重復性測量的相對標準不確定度為：

式中：Xi——測量值；

S(Xi)——標準偏差；

n-1——自由度。

由表4 可計算出Urel(F香蘭素)=0.012 798 40，Urel(F甲基香蘭素)=0.013 123 36，Urel(F乙基香蘭素)=0.022 175 51。

2.2.7 測量回收率產(chǎn)生的不確定度

依據(jù)2.2.6，在600.0 μg/kg 水平對6 份空白奶粉樣品進行加標，按照標準方法測定，得到測量回收率結果。依據(jù)貝塞爾（Besssel）公式，合成測量回收率的相對標準不確定度為：

式中：ri——回收率值；

S(Ri)——標準偏差；

n-1——自由度。

由此可以由表格X 計算出Urel(G香蘭素)=0.012 816 684，Urel(G甲基香蘭素)=0.013 101 677，Urel(G乙基香蘭素)=0.022 107 853。

2.2.8 測量儀器產(chǎn)生的不確定度

Agilent1290/6470 三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質譜的校準證書（CB201004144）提供的不確定度U=2%，k=2，按照正態(tài)分布，其產(chǎn)生的相對標準不確定度為Urel(H)=0.010。

2.3 合成標準不確定度因素的評定

2.3.1 合成總相對不確定度

由上述分析各個因素的相對不確定度公式，計算合成奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素含量測定結果的總相對不確定度。

香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的各因素相對不確定度見表5。

表5 香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素的各因素相對不確定度

2.3.2 擴展不確定度和測定結果

測試試驗結果，最后測試加標盲樣，香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素測定含量為100.0 μg/kg，依據(jù)取包含因子k=2，置信概率為95%時，香蘭素的擴展不確定度為Urel(X香蘭素)=C×k×Urel=100.0×2×0.035 57=7.1 μg/kg；甲基香蘭素的擴展不確定度為Urel(Y甲基香蘭素)=C×k×Urel=100.0×2×0.037 91=7.6 μg/kg；乙基香蘭素的擴展不確定度為Urel(Z乙基香蘭素)=C×k×Urel=100.0×2×0.042 16=8.4 μg/kg。由上述可得出，奶粉中香蘭素的含量表示為100.0±7.1 μg/kg，甲基香蘭素的含量表示為100.0±7.6 μg/kg，乙基香蘭素的含量表示為100.0±8.4 μg/kg，k=2。

4 結論

測試依據(jù)檢測方法對不確定因素的來源展開分析并對各分因素不確定度進行具體計算，由表5 可知，標準溶液稱量稀釋過程產(chǎn)生的相對標準不確定度為第一影響因素，其次是標準工作曲線擬合、重復性測量和測量回收率產(chǎn)生的相對標準不確定度，其余的樣品稱量、樣品提取過程、標準物質的純度及測量儀器產(chǎn)生的相對標準不確定度均比較低。為了提高測定結果的準確性，應該在系統(tǒng)誤差恒定的情況下，盡可能地在配制曲線上下重心，配制合適范圍的線性曲線，在實際檢測過程中，通過選擇穩(wěn)定的標準物質，增加校準標準物質的測試步驟，并對樣品進行平行測定，定時對天平設備和檢測設備進行維護校準，減少過程中的不確定度，并加強檢測人員的試驗操作規(guī)范化和熟練度。