低溫等離子體降解嘔吐毒素效果評價及降解規律解析

邢常瑞, 孔志康, 洪 靜, 趙璐玲, 陳露語, 袁 建, 嚴文靜

(南京財經大學食品科學與工程學院1,南京 210023)(南京農業大學食品科技學院2，南京 210095)

真菌毒素是糧食生長、收獲和儲藏環節需要高度重視的危害物。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，又稱為嘔吐毒素(Vomitoxin)，是小麥赤霉病發生過程中在糧食籽粒中產生的重要次級代謝產物，對人體和畜禽動物具有很強的毒性，已被國際癌癥研究機構列為第3類致癌物。在我國，小麥及相關麥類產品中DON的污染限量為1 000 μg/kg[1]。

小麥中DON超標會降低其經濟價值，造成動物拒食、生長停滯甚至中毒死亡。因此，國內外對糧食或飼料中DON的處理和降解做了廣泛研究。不同的處理方法已經用于糧食或其他食品中DON的降解并進行了評價，比如加熱烘烤[2]、化學試劑處理[3]、微生物酶促轉化[4]、超聲波處理[5]、輻照和光照處理[6]、臭氧處理[7]及低溫等離子處理[8]等。其中，低溫等離子體技術作為一種新型的非熱加工品質安全控制技術，近年來引起人們的廣泛興趣，可以殺滅食品中的微生物、降解真菌毒素并維持相關食品品質[9]。該技術及相關設備能產生包含具有高反應活性的組分(活性氧和活性氮)、離子、自由基、紫外線并與DON分子發生碰撞和反應使之降解，比單一使用臭氧或者紫外線的效率高[10]。

為評價等離子體氣降解DON的可行性，本研究采用同軸雙介質脈沖低溫等離子體設備產生等離子體氣對DON溶液進行處理，分析降解效率，鑒定相關降解產物并分析其毒性，同時對相關降解產物進行質譜裂解途徑分析，為后續等離子體相關設備及相關技術聯用在小麥及玉米中DON降解脫毒的應用提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

DON標準溶液，乙腈(色譜級)，同軸雙介質脈沖低溫等離子體設備，質譜儀(AB Sciex TripleTOF? 5600)，HMG001快速檢測及監測分析箱，DON膠體金定量檢測試紙條。

1.2 實驗方法

1.2.1 同軸雙介質脈沖低溫等離子體設備搭建

脈沖交流高壓電源為CTP-2000K，反應器采用同軸雙介質阻擋放電形式，介質管為石英玻璃材料，外部介質管長度350 mm，外徑25 mm，厚度2.5 mm，中心介質管長度350 mm，外徑8 mm，壁厚2 mm，介質管之間的空氣間隙為6 mm。高壓電極采用150目的不銹鋼網，電極網長度200 mm，居中套在外介質管外壁上并用鋼絲固定，低壓電極采用不銹鋼桿，直徑為4 mm，長度為400 mm，低壓電極桿兩端通過螺紋與兩端不銹鋼固定板連接，作為反應器低壓端，固定板上有與石英玻璃管截面尺寸一致的凹槽，可將石英玻璃管同軸定位，以形成同軸型雙介質阻擋放電結構，固定板上設置有進/出氣管，用于處理氣體產生等離子體。

1.2.2 等離子氣體處理溶液中的DON

配置500 ng/mL的DON溶液和空白水溶液5 mL，各取1 mL置于15 mL離心管中。調整等離子設備出氣口高度，保持出氣口與溶液液面1～2 cm距離，持續產生的等離子體氣對溶液進行吹掃。由于等離子氣體只在液面與DON進行接觸，為確保DON充分降解并獲得足夠的降解產物用于質譜檢測和結構分析，通過等離子氣吹干溶液，加入1 mL乙腈水溶液(50%)溶解，震蕩后過膜保存。

1.2.3 膠體金試紙條方法測試降解效果

按照LS/T 6113—2015《糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測定 膠體金快速定量法》采用膠體金快速檢測試紙條對降解效果進行測試[12]。

1.2.4 液質聯用儀測定降解效果及降解產物結構分析

采用LC-Triple ToF 5600高分辨質譜對DON降解前后進行分析和測試，測定經等離子氣吹干處理并重新垂懸的DON標準溶液(500 ng/mL)及空白水對照垂懸樣品溶液及未處理的DON標品溶液(500 ng/mL)。儀器采用正離子采集模式，色譜和質譜相關設置參考實驗室歷史使用條件[13]。對獲得數據使用Peak view 2.0和Metabolite Pilot進行降解產物預測和分析，通過Mass Frontier 7.0軟件對可能存在的分子的二級質譜進行分析。

1.2.5 基于質譜裂解碎片分析的DON低毒性降解產物確認

對于軟件給出的降解產物結構和相關信息進行分析，排除無二級質譜圖和二級質譜得分較低的結果，并分析降解后的化學式、中性質量、質核比(m/z)、保留時間及可能的轉化方式。同時深入分析等離子氣降解產物的降解規律，解析低毒性的降解產物的質譜碎片裂解規律，確認降解途徑。

1.2.6 基于膠體金快速定量檢測方法評價低溫等離子體對小麥的水提取液中DON降解效果

在恒溫恒濕箱中，將1 mL的禾谷鐮刀菌孢子液(5logCFU)噴灑到50 g經輻照的小麥表面，置于錐形瓶中搖混均勻，于28 ℃和85% 濕度條件下培養2 d，然后取出后在90 ℃烘箱中烘干2 h。將小麥分次在研磨儀中研磨30 s，合并小麥全粉并混合均勻。稱取6 g小麥粉，加入24 mL水提取液，震蕩提取3 min，在4 000 r/min條件下離心3 min，然后取3 mL上清溶液，將出氣口置于液面以下0.5 cm處，用等離子體氣分別處理 0、2、5、15 min。同時按同樣的方法做陰性小麥粉的對照實驗。小麥粉的水提取液及其等離子體處理后的溶液分別用膠體金快速試紙條法進行測定，評價降解效果。

2 結果與分析

2.1 DON標準溶液的降解效果

將1.2.2中配置的DON標品溶液經過等離子體吹干之后，加入1 mL乙腈水溶液(50%)溶解，震蕩后過膜，取30 μL 垂懸液加入270 μL樣品稀釋液，然后按照試紙條操作說明進行測定。同時將0、100、500 ng/mL的未經處理的標品溶液，用樣品稀釋液稀釋10倍后，按照同樣方法進行測定。結果顯示標品溶液(0、100、500 ng/mL)的RLU值(檢測線光密度值/控制線光密度值)分別為2.36、1.42和0.72；而經過等離子體吹干處理后的樣品的RLU值為2.2，數值接近于空白標品的檢測結果。說明等離子體處理后的樣品溶液經過長時間等離子體氣吹干處理，DON發生了降解反應。

DON標準品溶液經等離子體氣吹干溶解并過膜后，進行高分辨質譜檢測，色譜和質譜條件按照文獻方法[13]進行設置。同時操作等離子體處理的空白水對照組和未處理的500 ng/mL DON標品溶液。檢測結果表明，在未處理的500 ng/mL DON標品溶液中檢出DON，而經過處理的500 ng/mL DON標品溶液和空白水對照組中都未檢出，結果如圖1所示。測定結果與膠體金快速檢測結果一致。

注：選擇離子(297.133±0.002 5) u，a為500 ng/mL DON標準溶液，b為500 ng/mL DON標準溶液經過等離子體氣吹干后垂懸過膜溶液。圖1 DON分子結構及選擇離子流圖

2.2 主要降解產物的變化方式和檢測信息

根據LC-Triple ToF 5600檢測和分析，解析出以下15種DON降解產物，結果見表1和表2。主要發生的轉化方式為甲基化、去甲基化、去飽和、氫化、—H2O等，產物分子中性質量范圍在250.12～326.10。

表1 可能存在的DON降解物的檢測信息

根據分子結構預測信息可知，DON發生降解的位點主要在3位羥基、3-4位碳鍵、5位甲基、6位羥甲基、7-羥基、8位羰基、12位環氧基和15位羥基。研究表明12位環氧基的結構變化可以顯著降低DON的毒性[14]，3位和15位羥基的變化可以造成毒性的降低或者升高[4]；而另一個毒性基團9位烯鍵在等離子體處理中并未發生降解。卞科研究團隊[15]基于高效液相-四級桿軌道阱質譜儀研究了臭氧降解DON產物，其中報道的10個降解產物中有3個與本研究推導的產物具有相同的分子質量，其分子式分別為酮基化產物M4、氧化產物M10和去甲基和羧基化產物M2，進一步的結構信息確證，須結合核磁等技術進一步分析。盡管等離子體中的活性氧和活性氮對降解起到主要作用，本研究降解產物中氧原子個數最大為8個，低于卞科研究團隊發現的最大氧原子數量10個[15]，說明等離子體中臭氧的產生具有一定的降解效果，但是無法引起高比例的氧化降解。另外，在飽和臭氧濃度條件下，受到臭氧作用，降解可能發生在C9-10雙鍵，生成2個氧原子加成中間產物，而其余分子結構不發生變化，然而作者并未對可能結構進行質譜解析[16]。表2 中的結構為軟件給出的預測結構，其中M2、M4、M10與母體結構相比多了1個或者2個氧原子。也可能存在其他的結構形式，比如M14，有可能以de-epoxy-DON形式存在，這種轉化方式存在于熱處理和微生物轉化過程。因此，進一步的結構信息確證，需要通過核磁等其他技術分析。在這15個降解產物中，M14、M2和M3均在未降解的標品溶液中檢測到，這可能是標品純化工藝不足或者有機溶劑溶解配制后發生轉化導致。

表2 DON降解產物的結構預測信息

此外，DON分子結構的降解發生位點對膠體金免疫試紙條的檢測結果具有重要的影響。DON的抗體特異性是膠體金試紙條特異性和靈敏度的關鍵，在本研究中所使用的抗體對另外3種DON類似物分子具有不同的識別特性，結果見表3。DON的抗體特異性對3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇交叉反應率為小于70%，對15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和氧雪腐鐮刀菌烯醇交叉反應率為小于1%，說明抗體結合位點靠近4位和15位，稍微遠離3位。因此，在降解產物M1、M2、M4、M7、M10、M13，可以被膠體金試紙條方法檢出；而M3、M5、M6、M8、M9、M11、M12、M14和M15降解產物無法被膠體金試紙條方法檢出。膠體金試紙條的測試結果表明DON降解產物中M1、M2、M4、M7、M10、M13占優勢。

表3 DON抗體交叉反應率

2.3 DON環氧基降解產物的質譜裂解

根據母體DON分子的質譜結果并分析碎片歸屬，如圖2和圖3所示。結果表明，質譜檢測獲得的二級質譜峰基本能夠與軟件模擬裂解的結果對應。

圖2 DON一級質譜和二級質譜裂解圖

圖3 DON(C15H20O6/297.13)質譜裂解途徑

本研究通過Mass Frontier 7.0 對DON環氧基降解的3個產物進行碎片歸屬解析[5]。結果表明質譜碎片檢測結果與模擬分子斷裂結果大部分都能夠完美匹配，極少部分碎片分子質量有不大于0.1 u的差距，基本確定了3種降解產物的分子式、分子結構式、分子質量，化學反應方程結構式，結果如圖4～圖9所示，其中虛線表示應該存在一個中間斷裂產物，然而質譜并未檢測到，可能是由于相關的碎片信息強度很低。

圖4 DON降解產物M5一級質譜和二級質譜裂解圖

圖5 DON降解產物M5質譜裂解途徑

圖6 DON降解產物M11一級質譜和二級質譜裂解圖

圖7 DON降解產物M11質譜裂解途徑

圖9 DON降解產物M12質譜裂解途徑

2.4 低溫等離子體對小麥粉水提取液中DON的降解效果

DON在干制品中的降解效率比在溶液中低，因為在溶液中更加易于產生活性自由基[8]。本研究首先將等離子氣體在通入小麥粉水提取溶液中，按照0、2、5、15 min進行降解處理，通過膠體金快速試紙條檢測分析DON的降解效果。

陰性小麥1的儀器定量檢測RLU為2.37，表明為陰性小麥，不含有DON；而陽性小麥2檢測后檢測RLU值為0.78，儀器定量結果表明DON含量值大于4 000 μg/kg，繼續用陰性小麥粉水提取液將陽性小麥2提取液稀釋1倍后檢測(命名為陽性小麥3)，RLU值為1.09，儀器定量檢測換算后表明禾谷鐮刀菌高濃度污染的小麥中DON含量為5 078 μg/kg。

陰性小麥粉水提取液經過等離子氣處理2、5、15 min后，通過膠體金試紙條檢測RLU為2.37、2.24、3.5，表明樣品為陰性。陽性小麥研磨成粉后用水提取后，經過2、5、15 min處理后，試紙條檢測RLU分別為 1.86、1.17、1.16。

為便于計算降解效果，測定結果換算為處理后小麥粒中DON殘留值分別為350、2 134、2 181 μg/kg；分析結果可知，2 min降解處理，降解效率可達94%；而在處理5、15 min之后計算的DON殘留值反而增加，這可能是由于較長時間的等離子體處理導致小麥粉水提取液中蛋白質等組分發生復雜反應，增加了檢測過程的基質干擾。使用長時間處理的提取液會使膠體金定量試紙條出現檢測效果低估的情況。結果表明，溶液體系中2 min處理即可對DON具有明顯的降解效果，這為飼料及其他谷物發酵液或提取液中的DON降解技術的開發提供參考。

3 結論

溶液狀態的DON經過等離子體氣處理后，發生了降解反應，在小麥水提取液中對DON的降解效率超過94%。通過對標準溶液進行降解產物結構分析，推導出降解產物，其中部分降解產物與臭氧降解產物一致。主要發生降解的位點在3位羥基、3-4位碳鍵、5位甲基、6位羥甲基、7-羥基、8位羰基、12位環氧基和15位羥基。通過對降解產物進行質譜裂解碎片分析，確定了C15H22O5、C15H24O5和C16H24O5裂解途徑。