核桃蛋白對大米淀粉凝膠化及凝膠特性的影響

鄒靜怡， 尹婷婷， 劉傳菊， 聶榮祖， 湯尚文， 張 倩， 豁銀強

(湖北文理學院1，襄陽 441053)(襄陽市農業科學院2，襄陽 441057)

大米除了直接以米飯的形式食用外，也常被加工成米粉、米餅等各種特色食品，以大米為基礎原料加工食品的品質和營養價值主要取決于大米淀粉等主要組分。由于存在持水力低、脫水收縮、易回生及儲藏不穩定等缺陷，淀粉質產品在要求嚴格的工業化生產中存在一定的局限。隨著大米制品消費需求不斷增加，人們不斷研究尋找新的改善大米淀粉凝膠化和凝膠特性的方法。作為一種簡單直接的方式，物理混合蛋白質、親水膠體等能克服單一淀粉的某些缺陷[1,2]。蛋白質與淀粉通過氫鍵、疏水性相互作用、范德華力等發生作用，進而改變體系的流變、熱特性、淀粉消化率等物化特性，改善凝膠類食品的品質[3,4]。米蛋白通過降低脫水收縮率、增強持水力及抑制淀粉回生等，提高大米淀粉凝膠的品質[5]。基于凝膠化過程中產生的協同強化效果，有研究以淀粉和蛋白質為原料開發了系列具有新型功能特性的小吃和快餐類食品[6,7]。

核桃餅粕是加工核桃油時產生的副產物，含有50%左右的蛋白質，氨基酸共18種，其中8種必需氨基酸含量適中，并含有較多的精氨酸和谷氨酸。核桃餅粕因含丹寧等組分而具有苦澀味，目前主要作為飼料或肥料，可利用核桃餅粕制備蛋白濃縮物和蛋白分離物[8]，而將核桃蛋白應用于食品配方的研究還鮮有報道[9]。如能將其有效地應用于淀粉質食品，不僅能強化產品的營養價值，也可能改善淀粉質食品理化特性和食用品質。目前有關核桃蛋白對淀粉質凝膠化行為及凝膠特性影響的研究鮮有報道。本實驗研究核桃蛋白對大米淀粉糊化、流變、熱及凝膠質構和水分子狀態的影響，探究將核桃蛋白應用于淀粉質食品中的潛力，以期為開發設計具有期望特征的核桃蛋白-淀粉復合物凝膠類食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

秈米，市售；核桃粕。

JMLB-100膠體磨，TDL-5-A臺式離心機，闊誠800A多功能粉碎機，AR-2000 流變儀，TechMaster快速黏度儀，NM120-025V-I 低場核磁共振分析與成像儀，TA-2000 差示掃描量熱儀，TA.XT. Plus 質構儀。

1.2 方法

1.2.1 大米淀粉和核桃蛋白制備

大米淀粉制備參考Huo等[10]的方法。向500 g大米樣品中加入1 L 0.3%的NaOH溶液，室溫浸泡12 h，用膠體磨濕磨5 min，懸漿于室溫下電動攪拌1.5 h充分溶解蛋白質，3 200 g離心15 min，棄上清，向淀粉殘渣中再加入1 L 0.3%的NaOH溶液，重復攪拌和離心操作。每次堿液提取離心后，刮去表層黃棕色膠狀物。向離心所得淀粉殘渣中加入1.5 L蒸餾水分散沉淀，用0.5 mol/L的HCl溶液調pH至中性，3 200×g離心15 min，棄上清。向淀粉殘渣中加1 L蒸餾水洗滌，離心后棄上清，重復水洗3次。所得淀粉于45 ℃烘箱中干燥24 h，粉碎過80目篩，所得大米淀粉置于干燥器中室溫保存備用。

核桃分離蛋白的制備參考文獻[11,12]。100 g核桃粕用500 mL正己烷脫脂，過濾后在通風櫥內揮發溶劑，經粉碎機粉碎，過100目篩。向100 g粉樣中加入1 L乙醇溶液室溫攪拌洗滌1 h，過濾，濾餅于通風櫥中干燥，加2 L蒸餾水充分分散，用1 mol/L的NaOH溶液調pH至11，53 ℃磁力攪拌1.5 h，室溫下3 200×g離心15 min，用1 mol/L的HCl調上清液pH至4.5，室溫靜置1 h，3 200×g離心15 min，沉淀用1 L蒸餾水洗滌，3 200×g離心10 min，重復洗滌2次，冷凍干燥蛋白樣品經充分研磨后，用自封袋密封后于干燥器中室溫保存備用。

1.2.2 糊化特性測定

分別以0%、3%、6%、9%、12%的核桃蛋白代替大米淀粉，混合均勻。每份樣品精確稱取3.5 g加到預先加有25 g蒸餾水的RVA測試專用鋁桶，隨即用攪拌器上下攪拌均勻，迅速進行測試。測試程序為：50 ℃保持10 s，以0.2 ℃/s的速度勻速升溫至95 ℃，在95 ℃保持150 s后以0.2 ℃/s勻速降溫至50 ℃，在50 ℃保持90 s。測試的前10 s攪拌器轉速為960 r/min，隨后以160 r/min至實驗結束。利用儀器自帶軟件分析得到糊化溫度、峰值黏度、崩解值、回生值、最終黏度等糊化特征參數。

1.2.3 流變行為分析

混合樣品每份取0.3 g于螺口玻璃瓶內，加5 mL蒸餾水，室溫下磁力攪拌30 min，45 ℃攪拌30 min使其預糊化，90 ℃糊化30 min，糊化過程中不時搖動，所得淀粉糊冷卻至37 ℃后進行流變測試。40 mm平板夾具，間距1 000 μm，測試溫度37 ℃。靜態流變：獲得剪切速率0.1～100 s-1范圍的應力曲線。用Herchel-Bulkley模型對數據進行擬合。

τ=τ0+K(γ)n

式中：τ為剪切應力；τ0為屈服應力；K為稠度系數；γ為剪切速率；n為流變行為指數。

動態流變：收集體系彈性模量(G′)、黏性模量(G″)及損耗因子(tanδ)在0.1～100 rad/s范圍的數據值，應力設置為1%。

1.2.4 熱特性分析

每份樣品稱取大約5 mg于差示掃描量熱儀專用鋁盒中，加蒸餾水使干物質的質量與水的體積比為1∶2，密封后于4 ℃冰箱過夜使其充分水化。以空鋁盒作參照，進行DSC測試。吹掃氮氣50 mL/min，升溫速率為5 ℃/min，溫度掃描范圍為30～120 ℃。利用Universal analysis 2000軟件分析獲得相轉變的起始溫度(To)、峰值溫度(Tp)、終止溫度(Te)及焓值(ΔH)。

1.2.5 凝膠質構分析

用蒸餾水將混合不同量核桃蛋白的大米淀粉配制成25%的懸液，先45 ℃磁力攪拌30 min，隨后于90 ℃加熱30 min使其完全糊化，冷卻至室溫后置于4 ℃儲藏24 h使其老化，冷藏樣品回復到室溫后上機進行穿刺測試。測試參數為：測前速度2.0 mm/s，測中速度1.0 mm/s，測后速度2.0 mm/s，探頭類型為P/0.5。以破斷力和破斷距離分別表征凝膠強度和凝膠的可塑性。

1.2.6 凝膠中水分狀態分析

用1.2.5同樣的方法制備凝膠樣品。每份取5 g左右置于核磁管內上機測試。測試參數：以Q-FID模式校正，用CPMG序列采集樣品信號，TD、RFD、RG1、DRG、PRG和NS分別設置為300 050、0.18、20.0、4、1和4。指數衰減曲線反演后得到T2(橫向)弛豫圖譜，并得到T21、T22和T23不同弛豫時間峰的面積分數A21、A22和A23。

1.2.7 數據處理

每個實驗至少重復3次，結果以“平均值±標準差”表示。利用SAS 8.0進行方差分析，根據Duncan多重比較分析樣品間是否存在差異，顯著性水平設為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 糊化特征

由圖1可見，加熱到一定溫度時，濕熱作用引起大米淀粉顆粒膨脹使體系的黏度增加，相對于未添加核桃蛋白的對照樣品而言，含核桃蛋白大米淀粉體系黏度增加的速率更大。由于核桃蛋白的主要成分為球蛋白，在中性體系中受到濕熱作用傾向于形成納米級蠕蟲樣聚集體[13]。大米淀粉中添加乳清白蛋白和大豆分離蛋白也表現出類似的現象，具有親水性的納米級球蛋白能夠通過親水作用和氫鍵等非共價鍵與淀粉分子相互作用，進而加速淀粉顆粒的膨脹速度[14]。添加核桃蛋白樣品的黏度曲線以濃度依賴的方式總體下移，表明特定溫度下體系的黏度值隨核桃蛋白添加量增加而減小。由于蛋白替代部分淀粉減少了體系中淀粉特別是直鏈淀粉的有效濃度，添加蛋清蛋白的豌豆淀粉體系也出現類似的情況[15]，結果表明淀粉是決定蛋白-淀粉混合體系糊化黏度的主要因素。

圖1 核桃蛋白-大米淀粉RVA曲線

如表1所示，添加核桃蛋白使大米淀粉糊的峰值黏度、谷值黏度、最終黏度等糊化黏度參數均降低，而糊化溫度升高，相關參數變化程度隨核桃蛋白添加量增加而加劇，當加入12%的核桃蛋白時，峰值黏度、谷值黏度及最終黏度分別降低了30.77%、12.35%和14.65%，糊化溫度升高了8.89%。糊化溫度是黏度開始升高時的溫度，其與淀粉的水結合力密切相關，蛋白競爭性結合了體系中的水而降低了淀粉對水的吸收能力，進而延遲淀粉顆粒的膨脹。添加兵豆濃縮蛋白也會引起大麥淀粉出現類似的結果[16]。峰值黏度主要反映淀粉顆粒的膨脹能力，淀粉顆粒達到最大吸水量時，進一步吸水導致淀粉顆粒崩解而引起黏度降低。崩解值、最終黏度和回生值等黏度參數呈現出類似的變化規律，測試過程中連續加熱和攪拌導致膨脹的淀粉顆粒崩解(如鬼態淀粉)，產生崩解黏度，添加的蛋白質形成連續的凝膠網絡包裹在淀粉顆粒表面，增強了膨脹淀粉顆粒對機械剪切的抗性而使體系的崩解值降低。這種熱糊穩定性增強的原料適合應用到米糊等熱食產品。添加核桃蛋白降低了體系的回生值，表明蛋白與淀粉分子間發生了相互作用，阻礙了直鏈淀粉分子通過氫鍵重新排列成有序結構。體系的黏度主要受滲出的直鏈淀粉分子相互纏結作用的影響，但也不同程度地受添加蛋白量和蛋白質特性等因素的影響。核桃蛋白替代了部分大米淀粉，減少了體系的直鏈淀粉含量，進而降低了體系的峰值黏度、最終黏度及回生值的等糊化黏度參數。添加酪蛋白的玉米淀粉體系[17]及添加豌豆蛋白的豌豆淀粉體系[18]也得到類似結果。

表1 核桃蛋白-大米淀粉糊化特性參數

2.2 流變特性

2.2.1 靜態流變

圖2為添加不同量核桃蛋白大米淀粉糊的靜態流變曲線。所有樣品的剪切應力均隨剪切速率增加而加大，呈現出假塑性剪切稀釋特征。隨著核桃蛋白添加量增加，應力曲線整體下移，表明糊的強度減弱。

圖2 核桃蛋白-大米淀粉靜態流變曲線

采用Herschel-Bulkley模型對不同體系的穩態剪切數據進行擬合，結果如表2所示。所有樣品的決定系數(R2)均大于0.99，表明該方程擬合核桃蛋白-大米淀粉糊體系的流變行為擬合度較高。不同體系的流動行為指數(n)為0.32～0.43，均小于單位1，所有樣品都表現為非牛頓流體特征；n值隨核桃蛋白添加量增加而增大，即體系的假塑性隨核桃蛋白添加量增加而增強。隨著核桃蛋白含量增加，樣品的屈服應力(τ0)和稠度指數(K)均降低，當核桃蛋白質量分數為12%時，兩者分別降低了84.13%和58.04%。所有樣品糊的屈服應力均大于0，表明體系形成了一定的交聯網絡或組分間發生了相互交聯，流動啟動前需要施加一定的力來破壞這些結構。體系的稠度系數隨核桃蛋白添加量增加呈下降趨勢，表明淀粉分子和蛋白分子間的相互作用比較弱，添加蛋白使體系中淀粉的膨脹力降低而引起K值減小，其可能是核桃蛋白抑制了淀粉顆粒膨脹及直鏈淀粉的滲出，導致體系的黏度降低。

表2 核桃蛋白-大米淀粉靜態流變參數

2.2.2 動態流變

圖3為添加不同量核桃蛋白大米淀粉糊的動態流變曲線。不同樣品在頻率0～100 rad/s范圍內的儲能模量(G′)均明顯大于其耗能模量(G″)，且沒有交叉，表現為弱凝膠體的流變特征[19]。所有樣品糊的G′和G″曲線均隨頻率增加而增大，表明測試時樣品形成了弱凝膠，黏彈性表現為頻率依賴性。添加核桃蛋白使體系的G′和G″曲線以濃度依賴的方式逐漸下移，即在相同頻率下樣品糊的黏彈性均隨核桃蛋白添加量增加而不斷降低。添加的核桃蛋白分子位于淀粉顆粒表面，阻礙了淀粉顆粒吸水膨脹及直鏈淀粉分子滲出形成交聯網絡，進而使體系的G′和G″均以濃度依賴的方式降低。蛋清蛋白對豌豆淀粉糊[7]及綠豆蛋白對蕎麥淀粉糊[20]流變行為的影響也表現類似的現象。

圖3 核桃蛋白-大米淀粉糊頻率掃描曲線

圖3c為樣品的損耗因子(tanδ)隨頻率增加的曲線圖。tanδ表現出與G′和G″類似的變化趨勢，即所有樣品的tanδ均隨頻率增加而變大。曲線隨核桃蛋白量增加整體上移，表明添加核桃蛋白使體系的流變行為表現出更多的液態屬性，表明蛋白與淀粉分子間的作用比較弱，較低的應力就可以破壞顆粒間的結合力。整體來說，添加不同量核桃蛋白的大米淀粉糊均形成了弱凝膠體系，隨著核桃蛋白量增加，體系的黏性屬性增加而彈性屬性減弱。

2.3 熱特性

由圖4可見，所有樣品在60～85 ℃之間均出現2個明顯的吸熱峰，分別為峰G和峰M1，添加核桃蛋白對樣品的峰并沒有造成明顯的影響。大多數情況下淀粉質樣品在DSC測試中出現一個典型的吸熱峰，部分情況下出現多個吸熱峰，目前對多峰產生的機理還沒有形成一致的觀點。有研究認為，在含水量較少時，峰G和峰M1分別與晶體結構的凝膠化和熔融有關[21]；在中等含水量時，峰G和峰M1分別由淀粉中短程有序的螺旋結構解旋和長程有序結晶熔融形成的吸熱峰[22]；在含水量充分的情況下，峰G和峰M1分別由淀粉顆粒無定形區膨脹和結晶區崩解產生的吸熱峰[23]，或由熱穩定性不同的兩種結晶區凝膠化分別產生的吸熱峰[24]，也有學者提出其分別由淀粉顆粒內部中心的結晶片層和顆粒周圍的結晶片層凝膠化產生的吸熱峰[25]。天然淀粉是一種半結晶顆粒結構，結晶區主要由支鏈淀粉分支的雙螺旋堆積而成，無定形區含有一定量的短程螺旋結構。DSC測試過程中，淀粉顆粒吸水溶脹、短程雙螺旋結構解旋、結晶結構熔融等均會不同程度地吸收熱量，因此表現出不同的吸熱峰，吸熱峰的形狀和位置受淀粉來源和測試條件的影響。

圖4 核桃蛋白-大米淀粉DSC 曲線

所有樣品的峰G和峰M1在DSC曲線上均為2個區分明顯的獨立吸熱峰，由表3分析可見，隨著核桃蛋白加入量增加，峰G的起始溫度(T1o)和峰值溫度(T1p)呈現出增加的趨勢，而焓值(ΔH1)隨核桃蛋白量增加而不斷減小，加入核桃蛋白對峰G的終止溫度(T1e)影響不顯著。峰M1的起始溫度(T2o)隨核桃蛋白量增加呈現出向高溫方向偏移的趨勢，焓值(ΔH2)與峰G的變化規律相似，不同樣品的峰值溫度(T2p)和終止溫度(T2e)間差異不顯著。位于淀粉顆粒表面的核桃蛋白抑制了淀粉顆粒對水分子的吸收，或蛋白變性形成的交聯網絡結構妨礙了淀粉顆粒吸水發生相變，進而導致T1o、T1p及T2o向高溫方向偏移。ΔH1和ΔH2值降低與淀粉含量降低呈非線性關系，表明核桃蛋白和淀粉分子間的相互作用影響了淀粉相變的焓值，核桃蛋白與淀粉分子間形成氫鍵降低了淀粉顆粒相變所需的熱能，進而更少的熱量就能使含核桃蛋白體系中的淀粉顆粒完成相變。

表3 核桃蛋白-大米淀粉熱特性參數

2.4 凝膠質構

如圖5所示，凝膠穿刺曲線時的力隨壓縮時間延長呈近線性增加。添加核桃蛋白樣品的力增加速率略低于未添加的對照組樣品，添加12%核桃蛋白樣品的增加速率最小，表明添加核桃蛋白使大米淀粉凝膠的硬度略有減小。凝膠硬度是淀粉質食品的一項重要感官屬性，其反映糊化淀粉回生程度及凝膠的穩定性大小。添加核桃蛋白影響了淀粉分子間的氫鍵鍵合，進而抑制了淀粉的回生，使形成的凝膠體相對軟糯。Hank等[26]發現去除大麥淀粉表面的蛋白能夠獲得硬度更大的凝膠體，該結果從側面佐證了這一規律。分別以穿刺過程中凝膠破裂時的力和破斷距離表征凝膠的強度和韌性，結果見表4。隨著核桃蛋白量增加，樣品的強度和可塑性均不斷減小。凝膠強度表征淀粉凝膠內部分子間作用力的強弱，凝膠強度和韌性均與淀粉分子通過氫鍵形成的三維網絡結構強弱有關，主要受短程回生程度的影響。添加核桃蛋白不僅降低了體系中直鏈淀粉的有效濃度，也妨礙了淀粉分子間通過氫鍵作用形成有序的三維網絡結構，進而使凝膠的強度和韌性均減小。

圖5 核桃蛋白對大米淀粉凝膠穿刺曲線的影響

表4 核桃蛋白-大米淀粉凝膠質構參數

2.5 水分子狀態

橫向弛豫時間(T2)對水分子運動性的改變非常敏感，常用來表征擁有不同運動性的水分子狀態。T2越小表明體系中的水與基質結合得越緊密，水的運動性越低；T2越大，表明體系中水的自由度越大，體系的保水性或持水性越差。添加不同量核桃蛋白大米淀粉凝膠的T2弛豫時間譜如圖6所示。所有樣品均出現3個峰，不同樣品3個峰的位置差異不顯著，T21、T22和T23的峰值時間分別出現在0.86、10.72、86.97 ms附近，表明所有樣品均存在結合水、弱結合水和自由水3種狀態的水分子，各種狀態的水在不同體系的運動性大小類似。

圖6 核桃蛋白-大米淀粉凝膠水分狀態

對不同狀態水分子T2弛豫譜峰面積進行積分，不同樣品的峰面積比率A21、A22和A23如表5所示。添加核桃蛋白使凝膠體系中結合水含量增加而自由水含量降低，弱結合水含量變化差異不顯著。添加核桃蛋白可能阻礙了淀粉分子重新排列再結晶，使體系中淀粉分子通過氫鍵結合更多的水分子；核桃蛋白分子表面的一些極性基團與水分子通過氫鍵作用也會引起體系的結合水含量增加。淀粉回生再結晶釋放的水分子主要轉變成凝膠束縛的自由水，因此對弱結合水含量的影響不顯著。

表5 核桃蛋白-大米淀粉凝膠的A21、A22和A23

3 結論

加入核桃蛋白不僅能增加大米淀粉基制品的營養價值，對大米淀粉凝膠化及凝膠的特性也產生了顯著的影響。核桃蛋白抑制了淀粉顆粒膨脹及凝膠化過程中直鏈淀粉滲出，進而使大米淀粉的糊化溫度及相變溫度升高，而糊化黏度和相變焓值降低。由于干擾了淀粉分子之間的氫鍵作用，大米淀粉的回生值和崩解值隨核桃蛋白含量增加而不斷降低，凝膠體呈現出更高的穩定性。靜態流變結果顯示加入核桃蛋白使大米淀粉糊呈現出更多的液態屬性。因阻礙了淀粉糊中直鏈淀粉的重排再結晶，加入核桃蛋白使大米淀粉凝膠的結合水含量增加，自由水含量、硬度、彈性及韌性均降低。