高壓復(fù)合pH偏移預(yù)處理對大豆蛋白糖基化復(fù)合物結(jié)構(gòu)及乳化性質(zhì)影響

譚孟娜, 徐晶晶, 楊雪飛, 高海鸰, 羅水忠, 李興江, 鄭 志

(合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院；安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230601)

作為一種價(jià)格低廉，營養(yǎng)全面，兼具多種功能性質(zhì)的植物蛋白，大豆蛋白已被廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[1]。然而，大豆蛋白的分子構(gòu)象主要由氫鍵及二硫鍵所穩(wěn)定，形成了致密的球狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其水溶性和分散性較差，對自身乳化性能造成限制[2,3]。糖基化反應(yīng)，即羰氨反應(yīng)是指糖分子的羰基與蛋白質(zhì)的自由氨基經(jīng)縮合、聚合后生成多種風(fēng)味物質(zhì)的褐變反應(yīng)，反應(yīng)過程中無需向體系中添加額外試劑，被認(rèn)為是一種理想的蛋白改性方法[4]。Liu等[5]利用亞麻籽膠與大豆蛋白進(jìn)行接枝反應(yīng)，蛋白溶解性得到顯著改善。Li等[6]研究表明與未改性大豆蛋白相比，葡萄糖與大豆蛋白的美拉德反應(yīng)復(fù)合物表現(xiàn)出了良好的分子柔韌性和乳化性能。大豆蛋白緊密的分子結(jié)構(gòu)使部分糖基化反應(yīng)位點(diǎn)被包埋在分子內(nèi)部，無法與糖分子的羰基端充分接觸，因而會降低糖基化反應(yīng)效率[5]。因此，在糖基化反應(yīng)之前通過對大豆蛋白施加適當(dāng)?shù)奶幚恚梢允蛊浣Y(jié)構(gòu)充分伸展，增加糖基化反應(yīng)基團(tuán)的暴露量，以增大糖基化接枝反應(yīng)的發(fā)生概率[7]。

作為一種非熱加工技術(shù)，超高壓處理被廣泛應(yīng)用于蛋白的修飾和改性研究中[8]。高壓處理過程中可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子之間化學(xué)作用力及各種相互作用之間的轉(zhuǎn)換[9]，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開。然而，僅超高壓處理對蛋白質(zhì)的作用效果有限，因此高壓處理與其他方式的結(jié)合受到關(guān)注。pH偏移處理特別是堿性pH偏移處理可顯著改善蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶于極端pH值溶液中時(shí)，其分子側(cè)鏈上帶有大量同種電荷，致使蛋白分子因靜電排斥作用而發(fā)生結(jié)構(gòu)展開，當(dāng)pH值調(diào)回中性時(shí)，隨著靜電斥力的消失蛋白質(zhì)分子重新發(fā)生折疊。再次折疊后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相較于初始狀態(tài)較為疏松，功能性質(zhì)也隨之發(fā)生變化[10]。已有研究利用超高壓處理與堿性pH偏移處理相結(jié)合，使蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)展開，不溶性聚集體出現(xiàn)解聚行為[11]。

本研究采用超高壓協(xié)同堿性pH偏移共同處理SPI，使其結(jié)構(gòu)以較大程度展開，從而增加糖基化反應(yīng)位點(diǎn)的暴露量，以增大反應(yīng)幾率，再對經(jīng)預(yù)處理的SPI進(jìn)行糖基化接枝改性，考察不同預(yù)處理方式對糖基化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和乳化性質(zhì)的影響，為改善大豆蛋白的乳化性質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(SPI)、麥芽糊精(MD)為食品級；鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇、四硼酸鈉、1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HHP-M1超高壓處理設(shè)備，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，F(xiàn)iveGo 單通道pH計(jì)，F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機(jī)，Nicolet 67傅里葉紅外光譜儀，F(xiàn)2000熒光光譜儀，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，Synergy LX多功能酶標(biāo)儀，F(xiàn)A25高速剪切均質(zhì)機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 糖基化大豆分離蛋白的制備

取4 g大豆分離蛋白溶于100 mL蒸餾水。以2 mol/L NaOH將樣品溶液pH值調(diào)節(jié)至11，磁力攪拌30 min后將SPI溶液密封于聚乙烯袋，放入超高壓處理設(shè)備中，處理壓力梯度分別設(shè)置為100、200、300、400 MPa，處理時(shí)間設(shè)置為10 min。經(jīng)高壓處理后的樣品溶液轉(zhuǎn)移至燒杯中，以2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至7。向經(jīng)高壓復(fù)合pH偏移處理后的100 mL蛋白溶液中加入2 g麥芽糊精，攪拌均勻后95 ℃加熱30 min，冰水浴至室溫得到糖基化大豆分離蛋白，各樣品記為100Sh-M、200Sh-M、300Sh-M、400Sh-M。未經(jīng)高壓處理(0.1 MPa)而僅經(jīng)pH 11偏移處理的蛋白與麥芽糊精的糖基化產(chǎn)物記為0.1Sh-M。

相同條件下，僅經(jīng)10 min高壓處理(壓力梯度為100、200、300、400 MPa)的SPI樣品與麥芽糊精經(jīng)95 ℃加熱30 min得到的糖基化產(chǎn)物記為100S-M、200S-M、300S-M、400S-M。未經(jīng)任何處理的大豆分離蛋白作為對照組，記為SPI。SPI與麥芽糊精的糖基化產(chǎn)物記為0.1S-M。所有樣品于透析袋中(截留量為7 000 U)透析48 h后，進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.2 接枝度的測定

參照Shima等[12]的方法測定樣品的接枝度(DG)。OPA試劑的配制：取0.2 g OPA溶解于5 mL無水乙醇，加入0.2 g/mL SDS溶液12.5 mL、10 mmol/L四硼酸鈉溶液(pH 9.7)125 mL及β-巰基乙醇500 μL，經(jīng)混勻后以蒸餾水定容至250 mL。取200 μL樣品溶液(0.2%，W/V)與4 mL OPA試劑充分混合，35 ℃水浴條件下保溫2 min后，于340 nm條件下測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光值A(chǔ)1，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白與OPA試劑混合溶液的吸光值記為A0。接枝度(DG)按式(1)計(jì)算：

DG=(A0A1)/A0×100%

(1)

1.3.3 褐變程度測定

參照Chawla等[13]的方法，配制2 mg/mL的糖基化蛋白樣品溶液，測量時(shí)以蒸餾水為參比溶液，使用分光光度計(jì)測定各溶液在420 nm處的吸光值。

1.3.4 傅里葉紅外光譜測定

取1 mg樣品與100 mg溴化鉀粉末充分混合并研磨均勻，壓片后于紅外光譜儀艙室中進(jìn)行掃描。測試條件為：掃描范圍4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次。將1 600～1 700 cm-1處紅外圖譜信息導(dǎo)入Peak fit軟件，經(jīng)基線校正后對圖譜去卷積，再進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，至相關(guān)系數(shù)R2的擬合值恒定為止，各二級結(jié)構(gòu)所占百分比含量為其各自對應(yīng)的峰面積占比。

1.3.5 內(nèi)源熒光光譜測定

將樣品溶液配制為0.5 mg/mL，設(shè)定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長掃描范圍為300～400 nm，利用熒光分光光度計(jì)掃描樣品的內(nèi)源熒光光譜。

1.3.6 表面疏水性測定

參照Zhou等[14]的方法測定蛋白及糖基化樣品的表面疏水性。將樣品溶于蒸餾水中，質(zhì)量濃度為0.005～0.05 mg/mL，ANS濃度配制為8 mmol/L。測定前將50 μL ANS溶液加入4 mL樣品溶液中并渦旋混勻。設(shè)定激發(fā)波長和掃描波長分別為365、484 nm。以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線斜率即為樣品的表面疏水性(H0)。

1.3.7 乳化性測定

根據(jù)Cameron[15]的方法測定糖基化樣品的乳化活力和乳化穩(wěn)定性。將樣品溶于蒸餾水，使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL，取1 mL大豆油與4 mL樣品溶液混合均勻，用高速均質(zhì)機(jī)在13 000 r/min下均質(zhì)2 min，制備完成后立即從乳液底部取樣10 μL，與5 mL 1 mg/mL SDS溶液混合均勻，在500 nm處測得吸光值A(chǔ)0。均質(zhì)結(jié)束后第10 min，同樣從乳液底部取樣10 μL加入到SDS溶液中測得吸光值A(chǔ)10。測量時(shí)以1 mg/mL SDS溶液為參比溶液。樣品的乳化活性(EAI, m2/g)和乳化穩(wěn)定性(ESI, min)按式(2)、式(3)計(jì)算。

EAI=2×2.303×A0×D/[c×(1-φ×10 000)]

(2)

ESI=A0×10/(A0-A10)

(3)

式中：D為稀釋倍數(shù)；φ為乳液油相比例；c為乳液制備前蛋白的質(zhì)量濃度/mg/mL。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)作單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05時(shí)表示差異顯著。以O(shè)rigin 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同預(yù)處理方式對糖基化產(chǎn)物接枝度的影響

接枝度可衡量糖基化反應(yīng)的程度，接枝度增加，說明體系中蛋白的自由氨基含量減少[16]。由圖1可知，僅高壓處理?xiàng)l件下，糖基化產(chǎn)物的接枝度隨壓力水平的增加而增加。這是因?yàn)楦邏禾幚砜筛淖兊鞍捉Y(jié)構(gòu)，使蛋白分子發(fā)生解聚和結(jié)構(gòu)伸展[17]，可發(fā)生接枝反應(yīng)的自由氨基大量暴露于蛋白質(zhì)分子表面，促使更多的自由氨基與麥芽糊精的羰基發(fā)生接枝反應(yīng)，從而增大接枝程度。僅高壓處理可以促進(jìn)蛋白與糖的接枝反應(yīng)，這與Zheng等[18]的研究一致。相比單一高壓預(yù)處理，高壓復(fù)合pH偏移處理使接枝反應(yīng)速率加快，并且隨著壓力水平的增加，接枝度也逐步增大。這可能是因?yàn)閺?fù)合處理過程中，壓力水平的增大利于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，自由氨基與羰基的接觸幾率增大，糖基化反應(yīng)速率加快。

注：字母不同表示差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物接枝度的影響

2.2 不同預(yù)處理方式對糖基化產(chǎn)物褐變強(qiáng)度的影響

美拉德反應(yīng)過程中通常伴隨著褐變現(xiàn)象的發(fā)生，這是由于在反應(yīng)的高級階段有含氮類棕色化合物生成，這類物質(zhì)的特征波長為420 nm，因此420 nm處的吸光值可以指示反應(yīng)的褐變程度[19]。由圖2可知，相比于天然SPI與麥芽糊精的接枝產(chǎn)物，對SPI僅作pH 11偏移處理，褐變程度沒有變化，說明此時(shí)蛋白的展開程度有限。僅對SPI進(jìn)行高壓處理時(shí)，經(jīng)100、200 MPa高壓處理后，褐變程度變化不大，當(dāng)壓力達(dá)到300 MPa及以上時(shí)，褐變程度明顯增加。對SPI進(jìn)行復(fù)合處理時(shí)，壓力水平增加至200 MPa時(shí)褐變強(qiáng)度即出現(xiàn)大幅度的增加，表明相較于單一高壓處理，復(fù)合處理使蛋白分子獲得了更為松散、伸展的結(jié)構(gòu)，蛋白與糖的結(jié)合幾率增大，糖基化反應(yīng)程度增加，生成了更多深棕色物質(zhì)，因此420 nm處吸光值增大。

圖2 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物褐變強(qiáng)度的影響

2.3 SPI糖基化復(fù)合物紅外光譜分析

圖3 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物FTIR圖譜的影響

表1為利用酰胺Ⅰ帶處的紅外圖譜信息計(jì)算得出的不同糖基化產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)含量。根據(jù)Li等[25]的報(bào)道，各二級結(jié)構(gòu)與擬合圖譜中各峰的對應(yīng)關(guān)系為：1 648～1 664 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1為β-折疊結(jié)構(gòu)，1 664～1 681 cm-1為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 637～1 648 cm-1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。各子峰面積占酰胺Ⅰ帶總峰面積比例即為蛋白二級結(jié)構(gòu)含量。見表1，相較于對照組SPI，接枝物的α-螺旋所占比例減少，而β-折疊和無規(guī)卷曲比例增大，β-轉(zhuǎn)角含量變化幅度較小。蛋白質(zhì)的糖基化縮合反應(yīng)位點(diǎn)主要位于蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)及其附近區(qū)域的ε-氨基，故接枝反應(yīng)發(fā)生后復(fù)合物中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低[26]。由表中結(jié)果可知，相較于單一高壓處理，超高壓結(jié)合pH偏移處理使更多的ε-氨基參與到了接枝反應(yīng)中，因此α-螺旋含量下降幅度更大。相較于β-折疊與無規(guī)卷曲的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性來說，α-螺旋的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)，由表1中二級結(jié)構(gòu)含量的變化可推測，糖基化反應(yīng)前對蛋白施加預(yù)處理可以增強(qiáng)后續(xù)生成的糖基化產(chǎn)物的分子柔性[27]。

表1 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)含量的影響

2.4 SPI糖基化復(fù)合物內(nèi)源熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中色氨酸(Trp)等疏水性氨基酸對自身所處微環(huán)境的極性變化敏感度較高，發(fā)色團(tuán)所處微環(huán)境偏極性時(shí)可導(dǎo)致最大發(fā)射波長(λmax)發(fā)生紅移，猝滅劑(蛋白或溶劑本身)對發(fā)色團(tuán)起到熒光猝滅作用時(shí)可降低熒光強(qiáng)度，因此內(nèi)源熒光光譜可反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化程度[28]。由圖4可知，接枝物的熒光強(qiáng)度相比于未處理SPI明顯降低，Spotti等[29]在對乳清蛋白-葡聚糖共價(jià)復(fù)合物的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，并指出色氨酸殘基的周圍區(qū)域易被多糖鏈所屏蔽[30]。高壓處理可使糖基化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度顯著降低，并且在復(fù)合pH 11偏移處理后，熒光強(qiáng)度下降幅度變大，這是由于復(fù)合處理后接枝度增加，更多的麥芽糊精與蛋白發(fā)生接枝反應(yīng)，從而加強(qiáng)了糖分子對色氨酸殘基的熒光猝滅作用。未處理SPI的熒光最大發(fā)射波長λmax位于352 nm處，而接枝物的λmax均發(fā)生了紅移，說明接枝反應(yīng)可改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，使蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)趨于松散。這可能是由于復(fù)合處理破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，色氨酸殘基暴露量增多，其周圍微環(huán)境的極性增強(qiáng)[31]。此外，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化及疏水基團(tuán)的暴露作用也會導(dǎo)致此現(xiàn)象的發(fā)生[32]。

圖4 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物內(nèi)源熒光光譜的影響

2.5 SPI糖基化復(fù)合物表面疏水性分析

表面疏水性是指位于蛋白分子表面直接與極性溶液直接接觸的疏水性氨基酸數(shù)量，可影響蛋白其他功能性質(zhì)的發(fā)揮[33]。不同預(yù)處理?xiàng)l件對蛋白糖基化產(chǎn)物的表面疏水性如圖5所示。與天然SPI相比，未經(jīng)任何處理的SPI與麥芽糊精發(fā)生接枝反應(yīng)后，其疏水性顯著降低，這是因?yàn)辂溠亢c大豆蛋白接枝后體系內(nèi)產(chǎn)生了大量親水性羥基，復(fù)合物的親水性增加，疏水性則會降低[20]。Zhang等[34]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白-麥芽糊精的糖基化作用可降低接枝物的表面疏水性，Ma等[32]也發(fā)現(xiàn)糖基化反應(yīng)會抑制疏水基團(tuán)的暴露，這與本研究結(jié)果一致。僅高壓處理?xiàng)l件下，隨著壓力水平的上升，糖基化復(fù)合物的疏水性不斷升高，有研究表明超高壓處理可使蛋白分子內(nèi)部的疏水性氨基酸遷移到分子表面，從而提高其疏水性[35]。pH 11偏移處理可使糖基化復(fù)合物的疏水性顯著提高，當(dāng)引入超高壓(100、200 MPa)與pH 11偏移復(fù)合處理SPI后，復(fù)合物的疏水性明顯增加。盡管糖基化反應(yīng)會降低復(fù)合物的表面疏水性，但糖基化前對大豆蛋白的復(fù)合預(yù)處理可削弱這種作用，使SPI發(fā)生結(jié)構(gòu)伸展，內(nèi)部疏水性基團(tuán)從蛋白分子內(nèi)部轉(zhuǎn)移至分子表面，與溶液直接接觸的疏水性基團(tuán)數(shù)量增多。當(dāng)引入的壓力水平增加至300、400 MPa時(shí)，糖基化反應(yīng)程度增大，更多的麥芽糊精與大豆蛋白發(fā)生共價(jià)接枝，被引入的親水性羥基數(shù)量增加，接枝物的表面疏水性進(jìn)一步降低。

圖5 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物疏水性的影響

2.6 SPI糖基化復(fù)合物乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)構(gòu)象及其在溶液環(huán)境中的親疏水平衡決定了蛋白乳化活性及乳化穩(wěn)定性的大小[36,37]。乳化活性代表蛋白質(zhì)在外力作用下參與乳液界面形成的能力，乳化穩(wěn)定性代表乳液液滴在一定時(shí)間內(nèi)保持分散狀態(tài)，不發(fā)生絮凝和凝聚的能力[38]。由圖6可知，糖基化可使大豆蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性得到顯著改善。與未經(jīng)處理SPI直接進(jìn)行接枝反應(yīng)后所得糖基化產(chǎn)物相比，SPI經(jīng)低壓力水平處理后再進(jìn)行接枝反應(yīng)所得產(chǎn)物，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性提升效果有限，而高壓力水平對乳化性質(zhì)的改善效果更加明顯。這可能是因?yàn)閴毫λ捷^低時(shí)，對糖基化反應(yīng)的促進(jìn)效果有限。當(dāng)SPI經(jīng)高壓協(xié)同pH 11偏移復(fù)合處理后，糖基化產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性提升效果更加顯著。復(fù)合處理效果優(yōu)于單一高壓處理的原因可能有兩點(diǎn)：一是因?yàn)榻?jīng)復(fù)合處理后，蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)松散程度變大，疏水基團(tuán)暴露量增多。蛋白乳化過程中，與油相結(jié)合的疏水基團(tuán)數(shù)量變多，促進(jìn)了蛋白在乳液界面的吸附，從而阻止油滴發(fā)生聚合，提高其乳化性[39]。二是因?yàn)樘腔瘡?fù)合物中接入的糖鏈可增加蛋白膜厚度，乳化活性劑乳化穩(wěn)定性得以提高[40]。

圖6 不同預(yù)處理對糖基化產(chǎn)物乳化活性(EAI)及乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了超高壓協(xié)同堿性pH偏移處理對大豆分離蛋白糖基化反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：單一高壓處理或堿性pH偏移處理對糖基化反應(yīng)的促進(jìn)效果有限，而二者的復(fù)合處理可進(jìn)一步增大糖基化反應(yīng)程度，提高復(fù)合物的接枝度和褐變程度。相較于未經(jīng)處理SPI，大豆蛋白經(jīng)復(fù)合預(yù)處理后再與麥芽糊精經(jīng)糖基化反應(yīng)后所得產(chǎn)物，其乳化活性和乳化穩(wěn)定性均有所提升。