乳清分離蛋白-植物甾醇納米顆粒的制備與表征

周士嬌， 韓 璐， 路科揚， 謝鳳英， 齊寶坤， 李 楊,2

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，哈爾濱 150030)(黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院2，哈爾濱 150000)

植物甾醇(PSs)是膽固醇類似物，被歸為功能性脂類。自1950年以來，酯化和游離形式的PSs都以降低膽固醇以及其他生理效應(yīng)而聞名[1]。一般認為，每天攝入任何類型的PSs 2～3 g，血清總膽固醇和低密度脂蛋白大約會分別降低10%和15%[2]。PSs廣泛存在于富含植物物質(zhì)的飲食中，但從正常飲食中獲得的PSs含量為160～430 mg/d，幾乎不足以獲得顯著的健康益處[3]。因此，PSs已經(jīng)成為一種用于食品補充劑和食品配方的重要成分。盡管PSs具有潛在的吸引力，但由于其較高的熔點、較低的水溶性和油溶性以及具有白堊的味道，其用途一直受到限制。僅管植物甾醇的酯化作用能增強它們在油相中的溶解度，但酯化形式的PSs的應(yīng)用僅限于高脂肪食品，這無疑增加了脂肪的攝入。更多的研究表明乳化作用[4]、包埋[5]、乙氧基化[6]、納米乳[7]均能顯著提高PSs的水溶性，并提高其生物活性和應(yīng)用范圍。

蛋白質(zhì)在納米乳[8]和納米分散體[9]中作為乳化劑和載體材料得到了廣泛的應(yīng)用。然而目前所使用的酪蛋白酸鈉制備的PSs納米顆粒的生物利用度較低[10]。乳清分離蛋白(WPI)是從乳清中獲得的最純凈的蛋白質(zhì)，主要含有β-乳球蛋白、少量牛血清白蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白和其他蛋白質(zhì)[11]。WPI除具有較高的營養(yǎng)價值外，還具有凝膠、乳化、發(fā)泡和風味結(jié)合等優(yōu)良性能。因此，WPI不僅被廣泛用作乳制品、肉類和烘焙產(chǎn)品的關(guān)鍵功能成分[12]，也可作為天然載體材料用于制造食品級的遞送系統(tǒng)，如納米乳[13]和納米復(fù)合物[14]。另外，利用WPI生物材料合成的納米顆粒具有良好的藥物包封率和生物相容性，且對正常組織無毒等優(yōu)點[15]。

本研究以WPI為包埋壁材，PSs為芯材，制備和表征不同質(zhì)量比的WPSs納米顆粒，對納米顆粒的粒徑、包封率和熱力學(xué)性能、微觀結(jié)構(gòu)等進行評估，并進一步研究納米粒子的pH穩(wěn)定性、鹽離子穩(wěn)定性及體外釋放。旨在為水溶性PSs的制備提供參考，并為提高PSs發(fā)揮抑制小腸吸收膽固醇的作用提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白、植物甾醇(純度>95%)、胃蛋白酶、胰酶、膽鹽、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平，JJ-1增力電動攪拌器，JY 92-IIN超聲波細胞粉碎機，Allegra64R臺式高速冷凍離心機，PHS-3C型實驗室pH計，F(xiàn)J200分散均質(zhì)機，N-1100D-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，場發(fā)射掃描電子顯微鏡SU8010，Zetasize nanozs 90型粒度電位儀，UV-2600型紫外-可見分光光度計，IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜，SDT 650型熱重與差熱同步熱分析儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳清分離蛋白-植物甾醇(WPSs)納米顆粒的制備

根據(jù)Feng等[16]的方法制備WPSs納米顆粒，稍作修改。將WPI(1%)粉末分散在含有0.02%的疊氮化鈉的去離子水中攪拌1 h，使用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至7，攪拌30 min，放入4 ℃冰箱過夜使蛋白充分水合。將PSs加入到無水乙醇中，制備不同質(zhì)量濃度的PSs乙醇溶液。取40 mL WPI溶液，向其加入一定量的PSs乙醇溶液，使用分散均質(zhì)機8 000 r/min均質(zhì)3 min，然后400 W超聲處理10 min，旋蒸除去乙醇。WPI與PSs的最終質(zhì)量比分別為50∶1、25∶1、50∶3、25∶2、10∶1，得到的納米顆粒分別命名為WPSs-1、WPSs-2、WPSs-3、WPSs-4、WPSs-5。未加PSs的WPI做相同的處理作為對照。

1.3.2 粒徑和Zeta電位

使用粒度電位儀測定PSs納米顆粒的粒徑、多分散性指數(shù)和Zeta電位。用去離子水將PSs納米分散體稀釋至蛋白質(zhì)量分數(shù)約0.01%，PSs和去離子水的折射率分別為1.45和1.33。

1.3.3 包封率和載藥量

在新制備的納米分散體中加入一定量的己烷來溶解未包封的PSs。收集上部己烷，用氮氣吹干。殘留物用無水乙醇重新溶解，PSs含量根據(jù)Liu等[17]描述的方法進行測定。向重新溶解的殘留物溶液中加入硫磷鐵顯色劑，反應(yīng)15 min后，用紫外-可見分光光度計測定混合物在520 nm下的吸光度，根據(jù)純化PSs建立的標準曲線(R2>0.99)計算PSs含量。

包封率(%)定義為納米顆粒中包封的PSs量與總PSs量的相對比值。載藥量(g/100 g)定義為納米顆粒中PSs的含量與總蛋白含量的相對比值。

1.3.4 濁度

將待測樣品適當稀釋后(樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL)倒入石英比色皿中，在波長600 nm處測定樣品吸光度[18]。

1.3.5 差示掃描量熱法

使用熱重與差熱同步熱分析儀評估了樣品的熱穩(wěn)定性。稱取5～10 mg樣品密封在鋁盤中。密封樣本以10 ℃/min的掃描速度從25 ℃加熱到250 ℃，氮流被設(shè)定為25 mL/min。使用空坩堝作為參考。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜

采用傅里葉變換紅外光譜儀在室溫下記錄樣品的紅外光譜。將凍干的樣品與KBr混合(1∶100)，然后壓片。在400～4 000 cm-1的范圍內(nèi)記錄光譜，分辨率為4 cm-1。

1.3.7 微觀結(jié)構(gòu)

采用掃描電子顯微鏡觀察納米顆粒的微觀結(jié)構(gòu)。經(jīng)凍干的樣品附著在導(dǎo)電雙帶上，雙帶粘在托盤上。用吹膠球?qū)⒎勰┓稚⒃谀z帶上，吹走未附著的粉末，在15 kV加速電壓下進行觀察拍照。

1.3.8 pH和離子強度對納米分散體穩(wěn)定性的影響

離子強度測試用1 mol/L NaCl溶液或去離子水制備不同鹽濃度(0、100、200、300、400 mmol/L)的樣品。pH測試是將稀釋后的樣品調(diào)至不同的pH(3～7)。樣品在室溫下儲存過夜，然后分別測量顆粒大小和Zeta電位。

1.3.9 PSs體外釋放

將0.2 g NaCl、0.32 g胃蛋白酶溶于100 mL去離子水中，用濃鹽酸調(diào)至pH 1.2，制備模擬胃液。將0.68 g K2HPO4、0.88 g NaCl、0.5 g膽鹽、0.32 g胰酶溶于100 mL去離子水中，調(diào)至pH 7.0，得到模擬腸液。取10 mL新制備的納米分散體加30 mL模擬胃液，使用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至2，37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩孵育2 h，胃消化結(jié)束后，取20 mL胃消化混合物加入20 mL模擬腸液。37 ℃、100 r/min連續(xù)振蕩孵育2 h。每隔30 min收集1 mL消化液，使用離心機在10 000×g、4 ℃條件下離心30 min。將得到的沉淀用乙醇溶解，按上述1.3.3的方法測定消化液中PSs的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標準差。圖表制作采用OriginPro8.5軟件，使用SPSS 23.0進行ANOVA差異顯著性分析和方差分析(P<0.05為顯著性差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑和Zeta電位

WPI和WPSs納米顆粒的Zeta電位的值如圖1a所示。WPSs納米顆粒顯示出比WPI更低的Zeta電位值(P<0.05)，且隨著PSs濃度的增加顆粒表面負電位逐漸增加，表明更多的PSs黏附在蛋白表面，增加了其表面的負電荷。Von等[19]研究也表明添加綠茶多酚會導(dǎo)致β-乳球蛋白-綠茶多酚復(fù)合物Zeta電位值的降低。Zeta電位與體系的穩(wěn)定性有關(guān)。當Zeta電位低于-30 mV時，表明體系穩(wěn)定，這可能是由于強靜電斥力的作用[20]。所有WPSs納米顆粒Zeta電位均低于-30 mV，說明所制備的納米分散體皆穩(wěn)定。

圖1 不同質(zhì)量比的WPSs納米顆粒的Zeta電位、粒徑、多分散指數(shù)(PDI)

從圖1b中可以看出，WPSs納米顆粒的粒徑依賴于WPI/PSs質(zhì)量比。PSs含量越高，納米顆粒粒徑越小。這說明PSs的加入改變了WPI的性質(zhì)和粒徑的分布情況[21]。另外，WPI/PSs質(zhì)量比為25∶1時，納米顆粒的多分散指數(shù)(PDI)值達到最高，為0.285。進一步降低WPI/PSs質(zhì)量比，PDI逐漸降低，PDI值降低可能是由于PSs濃度較高，WPI和PSs相互作用更強，導(dǎo)致粒徑分布更均勻[22]。所有納米分散體PDI均小于0.3(圖1c)，說明粒徑分布窄，穩(wěn)定性好[23]。

2.2 包封率和載藥量

圖2顯示了WPSs納米顆粒中PSs的包封率和載藥量。可以看出所有樣品的包封率均在80%以上，隨著WPI/PSs質(zhì)量比的降低，包封率降低，說明隨著PSs濃度的逐漸增加，相對較多的PSs沉淀在顆粒表面和溶液中，而不是嵌入在蛋白基體中，這與PSs增加納米顆粒表面的負電荷結(jié)果一致。同時也可以看出，PSs載藥量隨PSs濃度的增加而升高，這與Patel等[24]研究的玉米醇溶蛋白和不同濃度姜黃素的結(jié)果一致。這主要是因為不同質(zhì)量濃度PSs與WPI的結(jié)合率幾乎相同，所以PSs的濃度越高，WPI結(jié)合的PSs含量越高。

圖2 不同質(zhì)量比的WPSs納米顆粒的載藥量和包封率

2.3 濁度和復(fù)溶穩(wěn)定性

不同WPI/PSs質(zhì)量比的納米分散體的濁度如圖3所示。可見納米分散體的濁度隨著PSs質(zhì)量濃度的增加而增加。在室溫下儲存48 h后，所有納米分散體未觀察到沉淀。這一觀察結(jié)果表明，WPI和PSs形成了具有良好抵抗重力的膠體粒子[25]。

圖3 初始納米分散體在600 nm處的吸光度

用初始和凍干后復(fù)溶納米分散體的粒徑大小、PDI變化來分析冷凍干燥對納米顆粒復(fù)溶穩(wěn)定性的影響。由表1可見，凍干導(dǎo)致了顆粒尺寸向較大的尺寸偏移，且隨著PSs濃度的增加，平均粒徑增加的幅度越大。另外，凍干后納米顆粒的PDI明顯增加，WPI/PSs質(zhì)量比從50∶1降低到10∶1，PDI從0.315增加到0.511，說明PSs濃度越大，凍干后的納米顆粒越不均一。復(fù)溶納米分散體在室溫下放置48 h后，PSs質(zhì)量濃度較低時，復(fù)溶納米分散體在動力學(xué)上是穩(wěn)定的，而PSs質(zhì)量濃度較高時，特別是WPI/PSs質(zhì)量比低于25∶2時，觀察到復(fù)溶納米分散體有明顯的沉淀，說明過量的PSs不利于納米顆粒的復(fù)溶。這可能是冷凍干燥引起PSs結(jié)晶導(dǎo)致的。

表1 凍干前后WPSs納米顆粒的粒徑和PDI

2.4 熱穩(wěn)定性

采用差示掃描量熱法研究了WPSs納米顆粒的熱穩(wěn)定性。各樣品的差示掃描量熱曲線如圖4所示。游離PSs分別在85.12 ℃和147.72 ℃出現(xiàn)2個吸熱峰，左峰為水分蒸發(fā)形成的脫水峰，右峰對應(yīng)PSs的熔點，表明其以晶體的形式存在[16]。在WPSs納米顆粒中PSs的右峰消失，說明PSs成功包埋在納米顆粒中，結(jié)晶度降低[10]。WPI出現(xiàn)了1個寬的吸熱峰，集中在87.54 ℃，隨著PSs質(zhì)量濃度的增加，吸熱峰所對應(yīng)的溫度增加到98.73 ℃，說明PSs的加入改善了WPSs納米顆粒的熱穩(wěn)定性。

圖4 不同質(zhì)量比WPSs納米顆粒差示掃描量熱曲線

2.5 傅里葉變換紅外光譜

圖5 不同質(zhì)量比WPSs納米顆粒傅里葉紅外光譜

2.6 微觀結(jié)構(gòu)

用掃描電子顯微鏡對PSs固體粉末、WPI凍干粉、不同質(zhì)量比的WPSs納米顆粒凍干粉的形貌進行觀察，結(jié)果如圖6所示。可以看到WPI結(jié)構(gòu)緊湊，邊緣銳利。PSs為雜亂的堆疊在一起的無定型態(tài)結(jié)構(gòu)。而WPI和PSs結(jié)合后微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。PSs質(zhì)量濃度較低時，WPSs納米顆粒形狀較為規(guī)整，呈清晰的球形(WPSs-1、WPSs-2)。PSs質(zhì)量濃度增加時，WPSs納米顆粒表現(xiàn)出網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(WPSs-3、WPSs-4)。當WPI:PSs質(zhì)量比達到10∶1時，可以看出顆粒聚集成塊狀(WPSs-5)。納米顆粒表面的不同可能與PSs在蛋白表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的排列不同有關(guān)。這不同于Liu等[29]用均質(zhì)法制備的層疊片狀乳清濃縮蛋白-植物甾醇膠體顆粒。與均質(zhì)法相比，在本研究中使用的超聲處理可能改變了WPI的空間結(jié)構(gòu)，增加了PSs與WPI的接觸面積，從而加強了PSs與WPI的相互作用，導(dǎo)致微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖6 PSs、WPI、WPSs納米顆粒凍干粉掃描電鏡觀察圖

2.7 pH穩(wěn)定性

WPSs納米顆粒的表面電位都是強pH依賴性的(圖7b)。顆粒表面電位隨著pH從7降至3由負變?yōu)檎瑑綦姾稍趐H 4.8左右為零。WPSs納米顆粒僅在較窄的pH范圍(pH 6.0～7.0)內(nèi)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。然而，當pH超出這個范圍時，特別是在蛋白等電點周圍，納米顆粒之間的靜電斥力減弱，導(dǎo)致納米顆粒聚集，從而使顆粒尺寸明顯增加(圖7a)[30]。

2.8 鹽離子穩(wěn)定性

NaCl的添加降低了WPSs納米顆粒表面負電位(圖7d)，這可能是反離子(Na+或Cl-)中和了納米顆粒表面的電荷所致。然而，WPSs納米顆粒粒徑?jīng)]有明顯變化(圖7c)，其穩(wěn)定性明顯高于玉米醇溶蛋白-植物甾醇納米顆粒[31]，說明WPSs納米顆粒對NaCl的添加(0～400 mmol/L)有較強的抗性。但通常在高鹽水平下，由于靜電斥力的屏蔽，蛋白顆粒往往容易聚集[32]。本研究WPSs納米顆粒更耐鹽，可能因為它們的顆粒尺寸相對較小。

圖7 WPSs-3納米顆粒在不同條件下的粒徑和Zeta電位

2.9 體外釋放

評價納米顆粒中生物活性物質(zhì)的釋放量對預(yù)測載體在食用食品過程中的行為具有重要意義。理想的納米包埋應(yīng)該在酸性的胃環(huán)境中保護生物活性成分。圖8顯示了WPSs-3納米顆粒在模擬胃腸中的釋放曲線。胃消化結(jié)束后，PSs累計釋放率達到16.51%，明顯低于玉米醇溶蛋白包埋的PSs納米顆粒的累計釋放率74.75%[31]，說明在模擬胃條件(pH2)下，WPSs納米顆粒穩(wěn)定性較好。因為乳清蛋白由大約55%的β-乳球蛋白組成，β-乳球蛋白具有致密的球狀結(jié)構(gòu)，所以在胃的酸性條件下具有很高的抗分解能力[33]。

圖8 WPSs-3納米顆粒在模擬腸胃中的釋放

腸消化后PSs累計釋放率達87.72%，PSs包埋率為92.65%，體系中約有94.68%的PSs釋放。在Saber等[34]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，包埋姜黃素的WPI納米顆粒在模擬胃條件可以抵抗胃蛋白酶的分解，而在腸道消化中，所制備的納米顆粒穩(wěn)定性破壞。因此，PSs主要在小腸中釋放，這有利于發(fā)揮其抑制腸內(nèi)膽固醇吸收的生理作用。

3 結(jié)論

利用超聲輔助反溶劑沉淀法制備了不同質(zhì)量比的WPSs納米顆粒。結(jié)果表明，隨著PSs濃度的增加，更多的PSs附著在WPI表面，從而導(dǎo)致WPSs納米顆粒表面Zeta負電位增加、包封率降低。PSs包埋在WPI中，增加了WPSs納米顆粒的熱穩(wěn)定性并改變了其二級結(jié)構(gòu)。PSs濃度發(fā)生改變時，PSs在WPI表面和內(nèi)部的分布不同，從而使WPSs納米顆粒呈現(xiàn)出不同的微觀結(jié)構(gòu)。WPI對PSs的載藥量隨PSs濃度的增加而增加，然而WPI/PSs質(zhì)量比低于25∶2時，復(fù)溶納米分散體在室溫下儲存48 h后出現(xiàn)沉淀，表明過多的PSs不利于納米顆粒的復(fù)溶。因此在制備WPSs納米顆粒時，WPI/PSs質(zhì)量比為25∶2是合適的比例。另外，該納米顆粒在高濃度鹽中粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化，穩(wěn)定性較好。在模擬體外消化中，納米顆粒主要在小腸中釋放PSs，這有利于發(fā)揮其抑制腸內(nèi)膽固醇吸收的生理作用。因此，基于WPI的納米顆粒是一種可以封裝PSs的材料。